Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Genski vektorji za zdravljenje pljučne cistične fibroze morajo biti usmerjeni na prevodne dihalne poti, saj periferna pljučna transdukcija nima terapevtskega učinka.Učinkovitost virusne transdukcije je neposredno povezana s časom zadrževanja nosilca.Vendar pa tekočine za dostavo, kot so nosilci genov, naravno difundirajo v alveole med vdihavanjem in terapevtski delci katere koli oblike se hitro odstranijo z mukociliarnim transportom.Podaljšanje časa zadrževanja genskih nosilcev v dihalih je pomembno, a težko dosegljivo.Magnetni delci, konjugirani z nosilcem, ki jih je mogoče usmeriti na površino dihalnih poti, lahko izboljšajo regionalno ciljanje.Zaradi težav s slikanjem in vivo je obnašanje tako majhnih magnetnih delcev na površini dihalnih poti v prisotnosti uporabljenega magnetnega polja slabo razumljeno.Namen te študije je bil uporabiti sinhrotronsko slikanje za vizualizacijo in vivo gibanja niza magnetnih delcev v sapniku anesteziranih podgan, da bi preučili dinamiko in vzorce obnašanja posameznih in skupnih delcev in vivo.Nato smo tudi ocenili, ali bi dostava lentivirusnih magnetnih delcev v prisotnosti magnetnega polja povečala učinkovitost transdukcije v sapniku podgan.Sinhrotronsko rentgensko slikanje prikazuje obnašanje magnetnih delcev v mirujočih in gibajočih se magnetnih poljih in vitro in in vivo.Delcev z magneti ni mogoče preprosto vleči po površini živih dihalnih poti, vendar se med transportom usedline koncentrirajo v vidnem polju, kjer je magnetno polje najmočnejše.Učinkovitost transdukcije se je povečala tudi za šestkrat, ko so bili lentivirusni magnetni delci dostavljeni v prisotnosti magnetnega polja.Ti rezultati skupaj kažejo, da so lentivirusni magnetni delci in magnetna polja lahko dragoceni pristopi za izboljšanje ciljanja genskih vektorjev in ravni transdukcije v prevodnih dihalnih poteh in vivo.
Cistično fibrozo (CF) povzročajo variacije v enem samem genu, imenovanem CF transmembranski prevodni regulator (CFTR).Protein CFTR je ionski kanal, ki je prisoten v številnih epitelijskih celicah po vsem telesu, vključno z dihalnimi potmi, glavnim mestom v patogenezi cistične fibroze.Napake v CFTR vodijo do nenormalnega transporta vode, dehidracije površine dihalnih poti in zmanjšane globine plasti tekočine na površini dihalnih poti (ASL).Prav tako zmanjša sposobnost mukociliarnega transportnega sistema (MCT), da očisti dihalne poti vdihanih delcev in patogenov.Naš cilj je razviti lentivirusno (LV) gensko terapijo za zagotavljanje pravilne kopije gena CFTR in izboljšati ASL, MCT in zdravje pljuč ter nadaljevati razvoj novih tehnologij, ki lahko merijo te parametre in vivo1.
Vektorji LV so eni izmed vodilnih kandidatov za gensko terapijo cistične fibroze, predvsem zato, ker lahko trajno integrirajo terapevtski gen v bazalne celice dihalnih poti (matične celice dihalnih poti).To je pomembno, ker lahko obnovijo normalno hidracijo in očistek sluzi z diferenciacijo v funkcionalne gensko popravljene površinske celice dihalnih poti, povezane s cistično fibrozo, kar ima za posledico vseživljenjske koristi.Vektorji LV morajo biti usmerjeni proti prevodnim dihalnim potem, saj se tu začne prizadetost pljuč pri CF.Dostava vektorja globlje v pljuča lahko povzroči alveolno transdukcijo, vendar to nima terapevtskega učinka pri cistični fibrozi.Vendar pa tekočine, kot so nosilci genov, naravno migrirajo v alveole, ko jih vdihavamo po porodu3,4, terapevtske delce pa MCT hitro izločijo v ustno votlino.Učinkovitost transdukcije LV je neposredno povezana s časom, v katerem vektor ostane blizu ciljnih celic, da omogoči celični privzem – "čas zadrževanja" 5, ki se zlahka skrajša s tipičnim regionalnim pretokom zraka ter usklajenim privzemom sluzi in delcev MCT.Za cistično fibrozo je zmožnost podaljšanja časa zadrževanja LV v dihalnih poteh pomembna za doseganje visokih ravni transdukcije na tem področju, vendar je bila doslej izziv.
Da bi premagali to oviro, predlagamo, da lahko magnetni delci LV (MP) pomagajo na dva komplementarna načina.Prvič, magnet jih lahko vodi do površine dihalnih poti, da izboljša ciljanje in pomaga delcem nosilca genov, da so na pravem območju dihalnih poti;in ASL) se premaknejo v celično plast 6. MP se pogosto uporabljajo kot tarčni prenašalci zdravil, ko se vežejo na protitelesa, zdravila za kemoterapijo ali druge majhne molekule, ki se pritrdijo na celične membrane ali se vežejo na svoje receptorje na površini celice in se kopičijo na mestih tumorja v prisotnost statične elektrike.Magnetna polja za zdravljenje raka 7. Druge "hipertermične" metode so namenjene ubijanju tumorskih celic s segrevanjem MP, ko so izpostavljeni nihajočim magnetnim poljem.Načelo magnetne transfekcije, pri katerem se magnetno polje uporablja kot transfekcijsko sredstvo za izboljšanje prenosa DNA v celice, se običajno uporablja in vitro z uporabo vrste nevirusnih in virusnih genskih vektorjev za celične linije, ki jih je težko transducirati. ..Ugotovljena je bila učinkovitost magnetotransfekcije LV z dostavo LV MP in vitro v celično linijo človeškega bronhialnega epitelija v prisotnosti statičnega magnetnega polja, kar je povečalo učinkovitost transdukcije za 186-krat v primerjavi s samim vektorjem LV.LV MT je bil uporabljen tudi pri in vitro modelu cistične fibroze, kjer je magnetna transfekcija povečala transdukcijo LV v kulturah vmesnika zrak-tekočina za faktor 20 v prisotnosti sputuma cistične fibroze10.Vendar je bila in vivo magnetotransfekcija organov deležna razmeroma malo pozornosti in je bila ovrednotena le v nekaj študijah na živalih 11, 12, 13, 14, 15, zlasti v pljučih 16, 17.Vendar pa so možnosti magnetne transfekcije pri zdravljenju pljuč pri cistični fibrozi jasne.Tan et al.(2020) je navedel, da bo »validacijska študija o učinkovitem vnosu magnetnih nanodelcev v pljuča utrla pot prihodnjim inhalacijskim strategijam CFTR za izboljšanje kliničnih rezultatov pri bolnikih s cistično fibrozo«6.
Obnašanje majhnih magnetnih delcev na površini dihalnih poti v prisotnosti uporabljenega magnetnega polja je težko vizualizirati in preučevati, zato so slabo razumljeni.V drugih študijah smo razvili metodo rentgenskega slikanja s faznim kontrastom na podlagi sinhrotronskega širjenja (PB-PCXI) za neinvazivno slikanje in kvantifikacijo minutnih in vivo sprememb globine ASL18 in obnašanja MCT19,20 za neposredno merjenje površinske hidracije plinskega kanala in se uporablja kot zgodnji pokazatelj učinkovitosti zdravljenja.Poleg tega naša metoda točkovanja MCT uporablja delce s premerom 10–35 µm, sestavljene iz aluminijevega oksida ali stekla z visokim lomnim indeksom, kot markerje MCT, vidne s PB-PCXI21.Obe metodi sta primerni za slikanje vrste delcev, vključno z MP.
Zaradi visoke prostorske in časovne ločljivosti so naši testi ASL in MCT, ki temeljijo na PB-PCXI, zelo primerni za preučevanje dinamike in vedenjskih vzorcev posameznih in velikih delcev in vivo, kar nam pomaga razumeti in optimizirati metode dostave genov MP.Pristop, ki ga uporabljamo tukaj, temelji na naših študijah z uporabo svetlobne linije SPring-8 BL20B2, v kateri smo vizualizirali gibanje tekočine po vnosu odmerka navideznega vektorja v nosne in pljučne dihalne poti miši, da bi pomagali razložiti naše opažene heterogene vzorce izražanja genov v našem genu.študije na živalih z nosilnim odmerkom 3,4 .
Namen te študije je bil uporabiti sinhrotron PB-PCXI za vizualizacijo in vivo gibanja serije MP v sapniku živih podgan.Te slikovne študije PB-PCXI so bile zasnovane za testiranje serije MP, jakosti magnetnega polja in lokacije, da bi ugotovili njihov učinek na gibanje MP.Predpostavili smo, da bi zunanje magnetno polje pomagalo dostavljenemu MF ostati ali se premakniti na ciljno območje.Te študije so nam tudi omogočile določitev konfiguracij magnetov, ki povečajo količino delcev, ki ostanejo v sapniku po odlaganju.V drugi seriji študij smo želeli uporabiti to optimalno konfiguracijo za prikaz vzorca transdukcije, ki izhaja iz in vivo dostave LV-MP v dihalne poti podgan, ob predpostavki, da bi dostava LV-MP v kontekstu ciljanja dihalnih poti povzročila pri povečani učinkovitosti transdukcije LV..
Vse študije na živalih so bile izvedene v skladu s protokoli, ki sta jih odobrila Univerza v Adelaidi (M-2019-060 in M-2020-022) in Odbor za etiko živali SPring-8 Synchrotron.Poskusi so bili izvedeni v skladu s priporočili ARRIVE.
Vse rentgenske slike so bile posnete na žarkovni liniji BL20XU na sinhrotronu SPring-8 na Japonskem z uporabo podobne nastavitve, kot je opisana prej 21, 22.Na kratko, eksperimentalna škatla je bila 245 m od sinhrotronskega skladiščnega obroča.Razdalja od vzorca do detektorja 0,6 m se uporablja za študije slikanja delcev in 0,3 m za študije slikanja in vivo za ustvarjanje učinkov faznega kontrasta.Uporabljen je bil monokromatski žarek z energijo 25 keV.Slike so bile pridobljene z uporabo rentgenskega pretvornika visoke ločljivosti (SPring-8 BM3), povezanega z detektorjem sCMOS.Pretvornik pretvori rentgenske žarke v vidno svetlobo z uporabo 10 µm debelega scintilatorja (Gd3Al2Ga3O12), ki se nato usmeri na senzor sCMOS z uporabo ×10 (NA 0,3) mikroskopskega objektiva.Detektor sCMOS je bil Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonska) z velikostjo niza 2048 × 2048 slikovnih pik in neobdelano velikostjo slikovnih pik 6,5 × 6,5 µm.Ta nastavitev daje efektivno izotropno velikost pikslov 0,51 µm in vidno polje približno 1,1 mm × 1,1 mm.Trajanje izpostavljenosti 100 ms je bilo izbrano za maksimiranje razmerja med signalom in šumom magnetnih delcev znotraj in zunaj dihalnih poti, hkrati pa zmanjša artefakte gibanja, ki jih povzroča dihanje.Za študije in vivo je bila na pot rentgenskega žarka nameščena hitra rentgenska zaklopka, ki je omejila odmerek sevanja z blokiranjem rentgenskega žarka med osvetlitvami.
Medij LV ni bil uporabljen v nobeni slikovni študiji SPring-8 PB-PCXI, ker komora za slikanje BL20XU ni certificirana za 2. stopnjo biološke varnosti.Namesto tega smo izbrali vrsto dobro opredeljenih MP od dveh komercialnih prodajalcev, ki pokrivajo vrsto velikosti, materialov, koncentracij železa in aplikacij - najprej, da bi razumeli, kako magnetna polja vplivajo na gibanje MP v steklenih kapilarah, nato pa v žive dihalne poti.površino.Velikost MP se giblje od 0,25 do 18 µm in je izdelana iz različnih materialov (glej tabelo 1), vendar sestava vsakega vzorca, vključno z velikostjo magnetnih delcev v MP, ni znana.Na podlagi naših obsežnih študij MCT 19, 20, 21, 23, 24 pričakujemo, da je MP do 5 µm mogoče videti na površini dihalnih poti sapnika, na primer z odštevanjem zaporednih sličic, da vidimo izboljšano vidljivost gibanja MP.En sam MP 0,25 µm je manjši od ločljivosti slikovne naprave, vendar se pričakuje, da bo PB-PCXI po nanosu zaznal njihov volumetrični kontrast in gibanje površinske tekočine, na katero so odloženi.
Vzorci za vsako MP v tabeli.1 smo pripravili v 20 μl steklenih kapilarah (Drummond Microcaps, PA, ZDA) z notranjim premerom 0, 63 mm.Korpuskularni delci so na voljo v vodi, CombiMag delci pa v lastni tekočini proizvajalca.Vsaka epruveta je do polovice napolnjena s tekočino (približno 11 µl) in nameščena na držalo vzorca (glejte sliko 1).Steklene kapilare so bile postavljene vodoravno na oder v komori za slikanje in postavljene na robove tekočine.Magnet iz nikljeve lupine s premerom 19 mm (28 mm) iz redke zemlje, neodija, železa in bora (NdFeB) (N35, kat. št. LM1652, Jaycar Electronics, Avstralija) z remanenco 1,17 T je bil pritrjen na ločeno mizo za prenos, da dosežete Na daljavo spremenite svoj položaj med upodabljanjem.Rentgensko slikanje se začne, ko je magnet nameščen približno 30 mm nad vzorcem in se slike pridobivajo s 4 slikami na sekundo.Med slikanjem je bil magnet približan stekleni kapilarni cevki (na razdalji približno 1 mm) in nato premaknjen vzdolž cevi, da bi ocenili učinek poljske jakosti in položaja.
Naprava za slikanje in vitro, ki vsebuje vzorce MP v steklenih kapilarah na stopnji translacije vzorca xy.Pot rentgenskega žarka je označena z rdečo pikčasto črto.
Ko je bila in vitro vidnost MPs vzpostavljena, je bila njihova podskupina testirana in vivo na divjih samicah albino podgan Wistar (starih približno 12 tednov, približno 200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonska), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonska) in butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Podgane smo anestezirali z mešanico Pharma (Japonska) z intraperitonealno injekcijo.Po anesteziji so jih pripravili na slikanje tako, da so odstranili dlako okoli sapnika, vstavili endotrahealni tubus (ET; 16 Ga intravenska kanila, Terumo BCT) in jih v ležečem položaju imobilizirali na po meri narejeno slikovno ploščo s termo vrečko. za vzdrževanje telesne temperature.22. Plošča za slikanje je bila nato pritrjena na vzorčni oder v škatli za slikanje pod rahlim kotom, da se je sapnik vodoravno poravnal na rentgenski sliki, kot je prikazano na sliki 2a.
( a ) Nastavitev slikanja in vivo v slikovni enoti SPring-8, pot rentgenskega žarka, označena z rdečo pikčasto črto.(b, c) Lokalizacija sapničnega magneta je bila izvedena na daljavo z uporabo dveh pravokotno nameščenih IP kamer.Na levi strani slike na zaslonu lahko vidite žično zanko, ki drži glavo, in kanilo za dovajanje, nameščeno znotraj ET cevi.
Daljinsko voden sistem črpalke za brizgo (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) z uporabo 100 µl steklene brizge je bil povezan s cevjo PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) z uporabo igle 30 Ga.Označite tubus, da zagotovite, da je konica pri vstavljanju endotrahealnega tubusa v pravilnem položaju v sapniku.Z uporabo mikročrpalke smo odstranili bat brizge in konico epruvete potopili v vzorec MP, ki ga je treba dostaviti.Naloženo dovodno cevko smo nato vstavili v endotrahealno cevko, konico pa postavili na najmočnejši del našega pričakovanega uporabljenega magnetnega polja.Zajem slike je bil nadzorovan z detektorjem dihanja, povezanim z našo časovno omarico, ki temelji na Arduinu, in vsi signali (npr. temperatura, dihanje, odprtje/zapiranje zaklopa in pridobivanje slike) so bili posneti z uporabo Powerlab in LabChart (AD Instruments, Sydney, Avstralija) 22 Pri slikanju Ko ohišje ni bilo na voljo, sta bili dve kameri IP (Panasonic BB-SC382) nameščeni pod kotom približno 90° druga glede na drugo in uporabljeni za nadzor položaja magneta glede na sapnik med slikanjem (slika 2b, c).Da bi zmanjšali artefakte gibanja, je bila med platojem končnega dihalnega toka pridobljena ena slika na vdih.
Magnet je pritrjen na drugo stopnjo, ki je lahko oddaljena na zunanji strani slikovnega telesa.Preizkušeni so bili različni položaji in konfiguracije magneta, vključno z: nameščenim pod kotom približno 30° nad sapnikom (konfiguracije so prikazane na slikah 2a in 3a);en magnet nad živaljo in drugi spodaj, s poli nastavljenimi za privlačnost (slika 3b)., en magnet nad živaljo in en spodaj, s poloma, nastavljenima za odboj (slika 3c), in en magnet nad in pravokotno na sapnik (slika 3d).Po nastavitvi živali in magneta ter nalaganju testiranega MP v črpalko za brizgo, po pridobitvi slik dostavite odmerek 50 µl s hitrostjo 4 µl/s.Magnet se nato premika naprej in nazaj vzdolž ali čez sapnik, medtem ko se nadaljuje pridobivanje slik.
Konfiguracija magneta za slikanje in vivo (a) en magnet nad sapnikom pod kotom približno 30°, (b) dva magneta, konfigurirana za privlačnost, (c) dva magneta, konfigurirana za odboj, (d) en magnet nad in pravokotno na sapnik.Opazovalec je pogledal navzdol od ust do pljuč skozi sapnik in rentgenski žarek je šel skozi levo stran podgane in zapustil desno stran.Magnet premikamo po dolžini dihalne poti ali levo in desno nad sapnikom v smeri rentgenskega žarka.
Prav tako smo poskušali ugotoviti vidnost in obnašanje delcev v dihalnih poteh v odsotnosti mešanja dihanja in srčnega utripa.Zato so bile ob koncu obdobja slikanja živali humano evtanazirane zaradi prevelikega odmerka pentobarbitala (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ZDA; ~65 mg/kg ip).Nekatere živali smo pustili na ploščadi za slikanje in po prenehanju dihanja in srčnega utripa postopek slikanja ponovili ter dodali dodatno dozo MP, če MP ni bil viden na površini dihalnih poti.
Nastale slike so bile popravljene za ravno in temno polje in nato sestavljene v film (20 sličic na sekundo; 15–25 × normalna hitrost, odvisno od stopnje dihanja) z uporabo skripta po meri, napisanega v MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Vse študije o dostavi genskih vektorjev LV so bile izvedene v raziskovalnem centru za laboratorijske živali Univerze v Adelaidi in so bile namenjene uporabi rezultatov eksperimenta SPring-8 za oceno, ali bi dostava LV-MP v prisotnosti magnetnega polja lahko izboljšala prenos genov in vivo .Za ovrednotenje učinkov MF in magnetnega polja smo zdravili dve skupini živali: eni skupini smo injicirali LV MF z namestitvijo magneta, drugi skupini pa smo injicirali kontrolno skupino z LV MF brez magneta.
Genski vektorji LV so bili ustvarjeni z uporabo predhodno opisanih metod 25, 26.Vektor LacZ izraža jedrsko lokaliziran gen beta-galaktozidaze, ki ga poganja konstitutivni promotor MPSV (LV-LacZ), ki proizvaja moder reakcijski produkt v transduciranih celicah, viden na sprednjih delih in odsekih pljučnega tkiva.Titracijo smo izvedli v celičnih kulturah z ročnim štetjem števila LacZ-pozitivnih celic z uporabo hemocitometra za izračun titra v TU/ml.Nosilci so kriokonzervirani pri -80 °C, odmrznjeni pred uporabo in vezani na CombiMag z mešanjem 1:1 in inkubacijo na ledu vsaj 30 minut pred dostavo.
Normalne podgane Sprague Dawley (n = 3/skupino, ~2-3 anestezirane ip z mešanico 0,4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Avstralija) in 60 mg/kg ketamina (Ilium, Avstralija) pri starosti 1 meseca) ip ) injiciranje in nekirurška oralna kanilacija z intravensko kanilo 16 Ga.Da bi zagotovili, da tkivo sapničnih dihalnih poti prejme transdukcijo LV, je bilo kondicionirano z uporabo našega predhodno opisanega protokola mehanske motnje, pri katerem je bila površina sapničnih dihalnih poti aksialno drgnjena z žično košaro (N-krog, ekstraktor nitinolnih kamnov brez konice NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ZDA) 30 str.28.Nato, približno 10 minut po motnjah v kabinetu za biološko varnost, smo izvedli trahealno dajanje LV-MP.
Magnetno polje, uporabljeno v tem poskusu, je bilo konfigurirano podobno kot pri rentgenski študiji in vivo, pri čemer so isti magneti držali nad sapnikom s sponkami za destilacijske opornice (slika 4).Volumen 50 µl (2 x 25 µl alikvota) LV-MP smo dostavili v sapnik (n = 3 živali) z uporabo pipete z gelsko konico, kot je opisano prej.Kontrolna skupina (n = 3 živali) je prejela enak LV-MP brez uporabe magneta.Po končani infuziji se kanila odstrani iz endotrahealnega tubusa in žival ekstubira.Magnet ostane na mestu 10 minut, preden ga odstranite.Podganam so subkutano dali meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Avstralija), čemur je sledil odvzem anestezije z intraperitonealno injekcijo 1 mg/kg atipamazolijevega klorida (Antisedan, Zoetis, Avstralija).Podgane so bile na toplem in opazovane do popolnega okrevanja od anestezije.
Naprava za dostavo LV-MP v kabinetu za biološko varnost.Vidite lahko, da svetlo sivi tulec Luer-lock cevke ET štrli iz ust, konica pipete za gel, prikazana na sliki, pa je vstavljena skozi cevko ET do želene globine v sapnik.
En teden po postopku dajanja LV-MP so bile živali humano žrtvovane z vdihavanjem 100 % CO2 in izražanje LacZ je bilo ocenjeno z našim standardnim zdravljenjem z X-gal.Trije najbolj repni hrustančni obroči so bili odstranjeni, da se zagotovi, da kakršna koli mehanska poškodba ali zastajanje tekočine zaradi namestitve endotrahealne cevke ne bo vključeno v analizo.Vsak sapnik je bil prerezan po dolžini, da smo dobili dve polovici za analizo, in dani v skodelico, ki je vsebovala silikonsko gumo (Sylgard, Dow Inc), z uporabo igle Minutien (Fine Science Tools) za vizualizacijo luminalne površine.Porazdelitev in značaj transduciranih celic sta bila potrjena s frontalno fotografijo z uporabo mikroskopa Nikon (SMZ1500) s kamero DigiLite in programsko opremo TCapture (Tucsen Photonics, Kitajska).Slike so bile pridobljene pri 20-kratni povečavi (vključno z največjo nastavitvijo za celotno širino sapnika), pri čemer je bila celotna dolžina sapnika prikazana korak za korakom, kar je zagotovilo dovolj prekrivanja med posameznimi slikami, da je mogoče slike "združiti".Slike iz vsakega sapnika so bile nato združene v eno samo sestavljeno sliko z uporabo urejevalnika sestavljenih slik različice 2.0.3 (Microsoft Research) z uporabo algoritma planarnega gibanja. Območje izražanja LacZ v sestavljenih slikah sapnika vsake živali je bilo kvantificirano z avtomatizirano skripto MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je opisano prej28, z uporabo nastavitev 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 in Value < 0,7. Območje izražanja LacZ v sestavljenih slikah sapnika iz vsake živali je bilo kvantificirano z avtomatiziranim skriptom MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je opisano prej28, z uporabo nastavitev 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 in Value < 0,7. Izrazite LacZ v sestavljenih slikah trahejev vsake živali, ki je bila količinsko določena z uporabo avtomatiziranega scenarija MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je opisano prej28, z uporabo nastavitev 0,35 <odtenek <0,58, nasičenost> 0,15 in <0 ,7. Območje izražanja LacZ v sestavljenih slikah sapnika vsake živali je bilo kvantificirano z uporabo avtomatizirane skripte MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je opisano prej28 z uporabo nastavitev 0,350,15 in vrednost<0,7.如 前所 述 ， 自动 自动 MATLAB 脚本 （R2020A ， MATHWORKS） 来自 来自 只 动物 的 气管 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 表达 区域 进行 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度> 0,15 和值 <0,7 设置。如 前所 述 ， 自动 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A ， MATHWORKS） 每 只 的 气管 复合 复合 图像 的 的 的 的 表达 表达 量化 ， 使用 使用 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 .................... KOLK Področja ekspresije LacZ na sestavljenih slikah trahejev vsakega živalskega števila so bila določena z avtomatizirano uporabo scenarija MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je bilo opisano prej, z uporabo nastavitve 0,35 <odtenek <0,58, nasičenost> 0,15 in vrednost <0,7 . Področja izražanja LacZ na sestavljenih slikah sapnika vsake živali so bila kvantificirana z uporabo avtomatizirane skripte MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je opisano prej z uporabo nastavitev 0,35 < barvni odtenek < 0,58, nasičenost > 0,15 in vrednost < 0,7.S sledenjem obrisom tkiva v GIMP v2.10.24 je bila za vsako sestavljeno sliko ročno ustvarjena maska ​​za identifikacijo območja tkiva in preprečevanje kakršnih koli lažnih zaznav zunaj trahealnega tkiva.Obarvane površine vseh sestavljenih slik vsake živali so bile seštete, da bi dobili skupno obarvano površino za to žival.Pobarvano območje smo nato delili s celotno površino maske, da smo dobili normalizirano območje.
Vsak sapnik je bil vstavljen v parafin in razrezan na 5 µm debeline.Odseki so bili kontrastno obarvani z nevtralno hitro rdečo barvo 5 minut in slike so bile pridobljene z uporabo mikroskopa Nikon Eclipse E400, kamere DS-Fi3 in programske opreme za zajem elementov NIS (različica 5.20.00).
Vse statistične analize so bile izvedene v GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistična značilnost je bila določena na p ≤ 0,05.Normalnost je bila testirana s testom Shapiro-Wilk, razlike v barvanju z LacZ pa so bile ocenjene z neparnim t-testom.
Šest MP, opisanih v tabeli 1, je pregledal PCXI, vidnost pa je opisana v tabeli 2. PCXI ni videl dveh polistirenskih MP (MP1 in MP2; 18 µm oziroma 0,25 µm), preostalih vzorcev pa je bilo mogoče identificirati. (primeri so prikazani na sliki 5).MP3 in MP4 sta slabo vidna (10-15 % Fe3O4; 0,25 µm oziroma 0,9 µm).Čeprav je MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) vseboval nekaj najmanjših testiranih delcev, je bil najbolj izrazit.Izdelek CombiMag MP6 je težko razlikovati.V vseh primerih se je naša sposobnost zaznavanja MF močno izboljšala s premikanjem magneta naprej in nazaj vzporedno s kapilaro.Ko so se magneti oddaljevali od kapilare, so bili delci potegnjeni ven v dolgih verigah, ko pa so se magneti približevali in se je magnetna poljska jakost povečala, so se verige delcev skrajšale, ko so se delci selili proti zgornji površini kapilare (glejte dodatni videoposnetek S1 : MP4), povečanje gostote delcev na površini.Nasprotno, ko se magnet odstrani iz kapilare, se poljska jakost zmanjša in MP-ji se prerazporedijo v dolge verige, ki segajo od zgornje površine kapilare (glejte dodatni video S2: MP4).Ko se magnet preneha premikati, se delci premikajo še nekaj časa, potem ko dosežejo ravnotežni položaj.Ko se MP premika proti zgornji površini kapilare in stran od nje, magnetni delci težijo k temu, da vlečejo ostanke skozi tekočino.
Vidnost MP pod PCXI se med vzorci precej razlikuje.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 in (d) MP6.Vse tukaj prikazane slike so bile posnete z magnetom, nameščenim približno 10 mm neposredno nad kapilaro.Navidezni veliki krogi so zračni mehurčki, ujeti v kapilare, ki jasno prikazujejo črno-bele robove fazno kontrastne slike.Rdeče polje označuje povečavo, ki poveča kontrast.Upoštevajte, da premeri magnetnih vezij na vseh slikah niso v merilu in so približno 100-krat večji od prikazanih.
Ko se magnet premika levo in desno vzdolž vrha kapilare, se kot niza MP spremeni, da se poravna z magnetom (glej sliko 6), s čimer se razmejijo črte magnetnega polja.Pri MP3-5, ko tetiva doseže mejni kot, se delci vlečejo po zgornji površini kapilare.Posledica tega je pogosto združevanje poslancev v večje skupine blizu mesta, kjer je magnetno polje najmočnejše (glejte dodatni video S3: MP5).To je še posebej očitno pri slikanju blizu konca kapilare, zaradi česar se MP agregira in koncentrira na vmesniku tekočina-zrak.Delci v MP6, ki jih je bilo težje razlikovati od tistih v MP3-5, se niso vlekli, ko se je magnet premikal vzdolž kapilare, vendar so strune MP disociirale, tako da so delci ostali vidni (glejte dodatni video S4: MP6).V nekaterih primerih, ko se je uporabljeno magnetno polje zmanjšalo s premikanjem magneta na veliko razdaljo od mesta slikanja, so se vsi preostali MP zaradi gravitacije počasi spustili na spodnjo površino cevi in ​​ostali v vrvici (glejte dodatni video S5: MP3) .
Kot niza MP se spreminja, ko se magnet premika v desno nad kapilaro.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 in (d) MP6.Rdeče polje označuje povečavo, ki poveča kontrast.Upoštevajte, da so dodatni videoposnetki informativni, saj razkrivajo pomembno strukturo delcev in dinamične informacije, ki jih na teh statičnih slikah ni mogoče prikazati.
Naši testi so pokazali, da počasno premikanje magneta naprej in nazaj vzdolž sapnika olajša vizualizacijo MF v kontekstu kompleksnega gibanja in vivo.Testi in vivo niso bili izvedeni, ker polistirenske kroglice (MP1 in MP2) niso bile vidne v kapilari.Vsak od preostalih štirih MF je bil testiran in vivo z dolgo osjo magneta, nameščenega nad sapnikom pod kotom približno 30° glede na navpičnico (glej sliki 2b in 3a), saj je to povzročilo daljše MF verige in je bilo učinkovitejše. kot magnet..konfiguracija prekinjena.MP3, MP4 in MP6 niso bili najdeni v sapniku nobene žive živali.Pri vizualizaciji dihalnih poti podgan po humani usmrtitvi živali so delci ostali nevidni tudi, ko je bil dodan dodaten volumen s črpalko na brizgo.MP5 je imel najvišjo vsebnost železovega oksida in je bil edini viden delec, zato je bil uporabljen za oceno in karakterizacijo obnašanja MP in vivo.
Namestitev magneta nad sapnik med vstavitvijo MF je povzročila, da se je veliko, vendar ne vseh, MF koncentriralo v vidnem polju.Vnos delcev v sapnik je najbolje opaziti pri humano evtanaziranih živalih.Slika 7 in dopolnilni video S6: MP5 prikazuje hitro magnetno zajemanje in poravnavo delcev na površini ventralnega sapnika, kar kaže, da je MP mogoče usmeriti na želena področja sapnika.Pri iskanju bolj distalno vzdolž sapnika po dostavi MF je bilo nekaj MF najdenih bližje karini, kar kaže na nezadostno jakost magnetnega polja za zbiranje in zadrževanje vseh MF, saj so bile dostavljene skozi območje največje jakosti magnetnega polja med dajanjem tekočine.postopek.Vendar pa so bile postnatalne koncentracije MP višje okoli območja slike, kar kaže, da je veliko MP ostalo v regijah dihalnih poti, kjer je bila uporabljena jakost magnetnega polja največja.
Slike (a) pred in (b) po vnosu MP5 v sapnik nedavno evtanazirane podgane z magnetom, nameščenim tik nad območjem slikanja.Upodobljeno območje se nahaja med dvema hrustančnima obročema.Pred dostavo MP je v dihalnih poteh nekaj tekočine.Rdeče polje označuje povečavo, ki poveča kontrast.Te slike so vzete iz videoposnetka v S6: dodatni videoposnetek MP5.
Premikanje magneta vzdolž sapnika in vivo je povzročilo spremembo kota verige MP na površini dihalnih poti, podobno kot pri kapilarah (glej sliko 8 in dodatni video S7: MP5).Vendar v naši študiji MP-jev ni bilo mogoče vleči po površini živih dihalnih poti, kot bi to lahko storile kapilare.V nekaterih primerih se veriga MP podaljša, ko se magnet premika levo in desno.Zanimivo je, da smo tudi ugotovili, da veriga delcev spremeni globino površinske plasti tekočine, ko magnet premaknemo vzdolžno vzdolž sapnika, in se razširi, ko se magnet premakne neposredno nad glavo in se veriga delcev zavrti v navpični položaj (glej Dodatni video S7).: MP5 pri 0:09, spodaj desno).Značilen vzorec gibanja se je spremenil, ko je bil magnet premaknjen bočno po vrhu sapnika (tj. levo ali desno od živali, namesto po dolžini sapnika).Delci so bili med gibanjem še vedno jasno vidni, ko pa so magnet odstranili iz sapnika, so postale vidne konice nizov delcev (glejte dodatni video S8: MP5, z začetkom pri 0:08).To se ujema z opazovanim obnašanjem magnetnega polja pod delovanjem uporabljenega magnetnega polja v stekleni kapilari.
Vzorčne slike, ki prikazujejo MP5 v sapniku žive anestezirane podgane.(a) Magnet se uporablja za pridobivanje slik nad in levo od sapnika, nato (b) po premikanju magneta v desno.Rdeče polje označuje povečavo, ki poveča kontrast.Te slike so iz videoposnetka v dodatnem videu S7: MP5.
Ko sta bila oba pola uglašena v smeri sever-jug nad in pod sapnikom (tj. privabljanje; slika 3b), so bile strune MP videti daljše in so bile nameščene na stranski steni sapnika in ne na hrbtni površini sapnika. sapnik (glej dodatek).Video S9:MP5).Vendar visoke koncentracije delcev na enem mestu (tj. na hrbtni površini sapnika) niso bile zaznane po dajanju tekočine z uporabo naprave z dvojnim magnetom, kar se običajno zgodi z napravo z enim magnetom.Potem, ko je bil en magnet konfiguriran za odganjanje nasprotnih polov (slika 3c), se število delcev, vidnih v vidnem polju, po dostavi ni povečalo.Nastavitev obeh konfiguracij magnetov je zahtevna zaradi visoke jakosti magnetnega polja, ki privlači oziroma potiska magnete.Nastavitev je bila nato spremenjena na en sam magnet, ki je vzporeden z dihalnimi potmi, vendar poteka skozi dihalne poti pod kotom 90 stopinj, tako da so črte sile prečkale steno sapnika pravokotno (slika 3d), usmeritev, namenjena ugotavljanju možnosti agregacije delcev na stransko steno.opazovati.Vendar v tej konfiguraciji ni bilo prepoznavnega kopičenja MF ali gibanja magneta.Na podlagi vseh teh rezultatov je bila izbrana konfiguracija z enim samim magnetom in 30-stopinjsko orientacijo za in vivo študije nosilcev genov (slika 3a).
Ko je bila žival večkrat posneta takoj po humani žrtvi, je odsotnost motečega gibanja tkiva pomenila, da je bilo v jasnem medhrustančnem polju mogoče razbrati tanjše, krajše črte delcev, ki so se 'zibale' v skladu s translacijskim gibanjem magneta.jasno vidi prisotnost in gibanje delcev MP6.
Titer LV-LacZ je bil 1,8 x 108 ie/ml in po mešanju 1:1 s CombiMag MP (MP6) so živali injicirali 50 µl trahealnega odmerka 9 x 107 ie/ml vehikla LV (tj. 4,5 x 106 TU/podgana).).).V teh študijah smo namesto premikanja magneta med porodom fiksirali magnet v en položaj, da bi ugotovili, ali bi lahko transdukcijo LV (a) izboljšali v primerjavi z vektorsko dostavo v odsotnosti magnetnega polja in (b) ali bi lahko dihalne poti biti osredotočen.Celice, ki se transducirajo v magnetnih ciljnih območjih zgornjih dihalnih poti.
Zdi se, da prisotnost magnetov in uporaba zdravila CombiMag v kombinaciji z vektorji LV nista škodljivo vplivala na zdravje živali, tako kot naš standardni protokol za dostavo vektorja LV.Čelne slike trahealne regije, ki je bila izpostavljena mehanskim motnjam (dopolnilna slika 1), so pokazale, da je imela skupina, zdravljena z LV-MP, bistveno višje ravni transdukcije v prisotnosti magneta (slika 9a).V kontrolni skupini je bila prisotna le majhna količina modrega LacZ obarvanja (slika 9b).Kvantifikacija normaliziranih regij, obarvanih z X-Gal, je pokazala, da je dajanje LV-MP v prisotnosti magnetnega polja povzročilo približno 6-kratno izboljšanje (slika 9c).
Primer sestavljenih slik, ki prikazujejo trahealno transdukcijo z LV-MP (a) v prisotnosti magnetnega polja in (b) v odsotnosti magneta.(c) Statistično značilno izboljšanje normaliziranega območja transdukcije LacZ v sapniku z uporabo magneta (*p = 0,029, t-test, n = 3 na skupino, povprečje ± standardna napaka povprečja).
Nevtralni hitro rdeče obarvani odseki (primer prikazan na dodatni sliki 2) so pokazali, da so bile celice, obarvane z LacZ, prisotne v istem vzorcu in na istem mestu, kot je bilo predhodno sporočeno.
Ključni izziv pri genskem zdravljenju dihalnih poti ostaja natančna lokalizacija delcev nosilca na zanimivih območjih in doseganje visoke stopnje učinkovitosti transdukcije v mobilnih pljučih ob prisotnosti zračnega toka in aktivnega očistka sluzi.Za nosilce LV, ki so namenjeni zdravljenju bolezni dihal pri cistični fibrozi, je bilo povečanje časa zadrževanja delcev nosilca v prevodnih dihalnih poteh doslej nedosegljiv cilj.Kot so poudarili Castellani et al., ima uporaba magnetnih polj za izboljšanje transdukcije prednosti pred drugimi metodami dostave genov, kot je elektroporacija, ker lahko združuje preprostost, ekonomičnost, lokalizirano dostavo, povečano učinkovitost in krajši čas inkubacije.in po možnosti manjši odmerek nosilca10.Vendar pa in vivo odlaganje in obnašanje magnetnih delcev v dihalnih poteh pod vplivom zunanjih magnetnih sil ni bilo nikoli opisano in dejansko sposobnost te metode za povečanje ravni izražanja genov v intaktnih živih dihalnih poteh ni bila dokazana in vivo.
Naši poskusi in vitro na sinhrotronu PCXI so pokazali, da so bili vsi delci, ki smo jih testirali, z izjemo polistirena MP, vidni v postavitvi slikanja, ki smo jo uporabili.V prisotnosti magnetnega polja magnetna polja tvorijo nize, katerih dolžina je povezana z vrsto delcev in jakostjo magnetnega polja (tj. bližina in gibanje magneta).Kot je prikazano na sliki 10, strune, ki jih opazujemo, nastanejo, ko se vsak posamezen delec namagneti in inducira lastno lokalno magnetno polje.Ta ločena polja povzročijo, da se drugi podobni delci zbirajo in povezujejo s skupinskimi gibi nizov zaradi lokalnih sil iz lokalnih sil privlačnosti in odbijanja drugih delcev.
Diagram, ki prikazuje (a, b) verige delcev, ki se tvorijo v kapilarah, napolnjenih s tekočino, in (c, d) sapnik, napolnjen z zrakom.Upoštevajte, da kapilare in sapnik niso narisani v merilu.Plošča (a) vsebuje tudi opis MF, ki vsebuje delce Fe3O4, razporejene v verige.
Ko se je magnet premaknil nad kapilaro, je kot niza delcev dosegel kritični prag za MP3-5, ki vsebuje Fe3O4, po katerem niz delcev ni več ostal v prvotnem položaju, ampak se je premaknil po površini v nov položaj.magnet.Do tega učinka verjetno pride, ker je površina steklene kapilare dovolj gladka, da omogoča to gibanje.Zanimivo je, da se MP6 (CombiMag) ni obnašal tako, morda zato, ker so bili delci manjši, so imeli drugačen premaz ali površinski naboj ali pa je lastniška nosilna tekočina vplivala na njihovo sposobnost premikanja.Kontrast na sliki delcev CombiMag je prav tako šibkejši, kar nakazuje, da imajo lahko tekočina in delci enako gostoto in se zato ne morejo preprosto premikati drug proti drugemu.Delci se lahko tudi zagozdijo, če se magnet premika prehitro, kar kaže, da jakost magnetnega polja ne more vedno premagati trenja med delci v tekočini, kar nakazuje, da jakost magnetnega polja in razdalja med magnetom in ciljnim območjem ne smeta biti presenečenje.pomembno.Ti rezultati tudi kažejo, da čeprav lahko magneti zajamejo veliko mikrodelcev, ki tečejo skozi ciljno območje, je malo verjetno, da bi se na magnete lahko zanesli pri premikanju delcev CombiMag po površini sapnika.Tako smo ugotovili, da bi morale študije LV MF in vivo uporabljati statična magnetna polja za fizično ciljanje na določena področja drevesa dihalnih poti.
Ko so delci dostavljeni v telo, jih je težko identificirati v kontekstu kompleksnega premikajočega se tkiva telesa, vendar je bila njihova sposobnost zaznavanja izboljšana z vodoravnim premikanjem magneta nad sapnikom, da "miga" strune MP.Medtem ko je slikanje v realnem času možno, je lažje zaznati gibanje delcev po humani usmrtitvi živali.Koncentracije MP so bile običajno najvišje na tem mestu, ko je bil magnet nameščen nad območjem slikanja, čeprav so bili nekateri delci običajno najdeni nižje v sapniku.Za razliko od študij in vitro delcev ni mogoče povleči po sapniku z gibanjem magneta.Ta ugotovitev je skladna s tem, kako sluz, ki prekriva površino sapnika, običajno predeluje vdihane delce, jih ujame v sluz in jih nato očisti prek mehanizma mukociliarnega čiščenja.
Domnevali smo, da bi lahko uporaba magnetov nad in pod sapnikom za privlačnost (slika 3b) povzročila bolj enakomerno magnetno polje, namesto magnetnega polja, ki je močno koncentrirano na eni točki, kar bi lahko povzročilo bolj enakomerno porazdelitev delcev..Vendar naša predhodna študija ni našla jasnih dokazov, ki bi podprli to hipotezo.Podobno nastavitev para magnetov na odboj (slika 3c) ni povzročila večjega usedanja delcev na območju slike.Ti dve ugotovitvi kažeta, da nastavitev z dvojnim magnetom bistveno ne izboljša lokalnega nadzora usmerjanja MP in da je posledične močne magnetne sile težko nastaviti, zaradi česar je ta pristop manj praktičen.Podobno usmeritev magneta nad in čez sapnik (slika 3d) prav tako ni povečala števila delcev, ki so ostali na posnetem območju.Nekatere od teh alternativnih konfiguracij morda ne bodo uspešne, saj povzročijo zmanjšanje jakosti magnetnega polja v območju nanašanja.Tako se konfiguracija z enim magnetom pri 30 stopinjah (slika 3a) šteje za najpreprostejšo in najučinkovitejšo metodo testiranja in vivo.
Študija LV-MP je pokazala, da so se ravni transdukcije v sapniku znatno povečale v primerjavi s kontrolami, ko so bili vektorji LV kombinirani s CombiMagom in dostavljeni po fizičnih motnjah v prisotnosti magnetnega polja.Na podlagi študij sinhrotronskega slikanja in rezultatov LacZ je bilo videti, da je magnetno polje sposobno zadržati LV v sapniku in zmanjšati število vektorskih delcev, ki so takoj prodrli globoko v pljuča.Takšne izboljšave ciljanja lahko vodijo do večje učinkovitosti, hkrati pa zmanjšajo dostavljene titre, neciljano transdukcijo, vnetne in imunske stranske učinke ter stroške prenosa genov.Pomembno je, da se po navedbah proizvajalca CombiMag lahko uporablja v kombinaciji z drugimi metodami prenosa genov, vključno z drugimi virusnimi vektorji (kot je AAV) in nukleinskimi kislinami.