Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Toxoplasma gondii je znotrajcelični protozojski parazit, ki spreminja mikrookolje okuženega gostitelja in je znano, da je povezan s pojavnostjo rasti možganskega tumorja.V tej študiji domnevamo, da eksosomska miRNA-21 iz okužbe s toksoplazmo spodbuja rast možganskega tumorja.Eksosomi mikroglije BV2, okužene s toksoplazmo, so bili karakterizirani in potrjena je bila internalizacija celic glioma U87.Ekspresijske profile eksosomske mikroRNA so analizirali z uporabo nizov mikroRNA in mikroRNA-21A-5p, povezanih s Toxoplasma gondii in razvrščanjem tumorjev.Raziskali smo tudi ravni mRNA genov, povezanih s tumorjem, v celicah glioma U87 s spreminjanjem ravni miR-21 v eksosomih in učinek eksosomov na proliferacijo celic glioma U87.V eksosomih celic glioma U87, okuženih s Toxoplasma gondii, se poveča izražanje mikroRNA-21 in zmanjša aktivnost protitumorskih genov (FoxO1, PTEN in PDCD4).Eksosomi, pridobljeni iz BV2, okuženi s toksoplazmo, inducirajo proliferacijo celic glioma U87.Eksosomi inducirajo rast celic U87 v modelu mišjega tumorja.Predlagamo, da lahko povečan eksosomalni miR-21 v mikrogli BV2, okuženi s toksoplazmo, igra pomembno vlogo kot promotor rasti celic v celicah glioma U87 z znižanjem protitumorskih genov.
Ocenjuje se, da je bilo leta 2018 po vsem svetu diagnosticiranih več kot 18,1 milijona primerov napredovalega raka, pri čemer je bilo vsako leto diagnosticiranih približno 297.000 tumorjev centralnega živčnega sistema (1,6 % vseh tumorjev)1.Prejšnje raziskave so pokazale, da dejavniki tveganja za razvoj človeških možganskih tumorjev vključujejo različne kemične izdelke, družinsko anamnezo in ionizirajoče sevanje iz terapevtske in diagnostične opreme za glavo.Vendar natančen vzrok teh malignomov ni znan.Približno 20 % vseh rakov po svetu povzročijo povzročitelji okužb, vključno z virusi, bakterijami in paraziti3,4.Infektivni patogeni zmotijo ​​genetske mehanizme gostiteljske celice, kot sta popravilo DNK in celični cikel, ter lahko povzročijo kronično vnetje in poškodbe imunskega sistema5.
Povzročitelji okužb, povezani z rakom pri ljudeh, so najpogostejši virusni patogeni, vključno s humanimi papiloma virusi ter virusi hepatitisa B in C.Paraziti imajo lahko tudi potencialno vlogo pri razvoju raka pri ljudeh.Več vrst parazitov, in sicer Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis in Hymenolepis nana, je bilo vpletenih v različne vrste raka pri ljudeh 6,7,8.
Toxoplasma gondii je znotrajcelični protozoan, ki uravnava mikrookolje okuženih gostiteljskih celic.Ocenjuje se, da ta parazit okuži približno 30 % svetovnega prebivalstva, kar ogroža celotno populacijo9,10.Toxoplasma gondii lahko okuži vitalne organe, vključno z osrednjim živčnim sistemom (CNS), in povzroči resne bolezni, kot sta usodni meningitis in encefalitis, zlasti pri bolnikih z oslabelim imunskim sistemom9.Vendar pa lahko Toxoplasma gondii spremeni tudi okolje okuženega gostitelja z modulacijo celične rasti in imunskih odzivov pri imunokompetentnih posameznikih, kar vodi do vzdrževanja asimptomatske kronične okužbe9,11.Zanimivo je, da glede na korelacijo med razširjenostjo T. gondii in pojavnostjo možganskega tumorja nekatera poročila kažejo, da in vivo gostiteljske okoljske spremembe zaradi kronične okužbe s T. gondii spominjajo na tumorsko mikrookolje.
Eksosomi so znani kot medcelični komunikatorji, ki dostavljajo biološko vsebino, vključno z beljakovinami in nukleinskimi kislinami, iz sosednjih celic 16, 17.Eksosomi lahko vplivajo na biološke procese, povezane s tumorjem, kot so anti-apoptoza, angiogeneza in metastaze v tumorskem mikrookolju.Zlasti miRNA (miRNA), majhne nekodirajoče RNA, dolge približno 22 nukleotidov, so pomembni regulatorji genov po transkripciji, ki nadzorujejo več kot 30 % človeške mRNA prek miRNA-induciranega kompleksa za utišanje (miRISC).Toxoplasma gondii lahko moti biološke procese z nadzorom izražanja miRNA v okuženih gostiteljih.Gostiteljske miRNA vsebujejo pomembne signale za uravnavanje bioloških procesov gostitelja za doseganje strategije preživetja parazita.Tako nam lahko proučevanje sprememb v profilu miRNA gostitelja po okužbi s T. gondii pomaga jasneje razumeti interakcijo med gostiteljem in T. gondii.Thirugnanam et al.15 je predlagal, da T. gondii spodbuja rakotvornost možganov s spreminjanjem njegove ekspresije na specifičnih gostiteljskih miRNA, povezanih z rastjo tumorja, in ugotovil, da lahko T. gondii povzroči gliome pri poskusnih živalih.
Ta študija se osredotoča na spremembo eksosomske miR-21 v gostiteljski mikrogliji, okuženi s toksoplazmo BV2.Opazili smo možno vlogo spremenjenega eksosomskega miR-21 pri rasti celic glioma U87 zaradi zadrževanja v jedru FoxO1/p27, ki je tarča prekomerno izraženega miR-21.
Eksosomi, pridobljeni iz BV2, so bili pridobljeni z diferencialnim centrifugiranjem in validirani z različnimi metodami za preprečevanje kontaminacije s celičnimi komponentami ali drugimi vezikli.Elektroforeza v SDS-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) je pokazala različne vzorce med beljakovinami, ekstrahiranimi iz celic BV2 in eksosomov (slika 1A), vzorci pa so bili ocenjeni na prisotnost Alixa, ki je bil analiziran z Western blottingom markerjev eksosomskih beljakovin v .Označevanje z alixom je bilo ugotovljeno v eksosomskih proteinih, ne pa tudi v beljakovinah celičnega lizata BV2 (slika 1B).Poleg tega je bila prečiščena RNA iz eksosomov, pridobljenih iz BV2, analizirana z bioanalizatorjem.Ribosomske podenote 18S in 28S so redko opazili v vzorcu migracije eksosomske RNA, kar kaže na zanesljivo čistost (slika 1C).Končno je transmisijska elektronska mikroskopija pokazala, da so opazovani eksosomi veliki približno 60–150 nm in imajo skodelico podobno strukturo, značilno za morfologijo eksosomov (slika 1D).
Karakterizacija eksosomov, pridobljenih iz celic BV2.(A) Stran z varnostnim listom.Proteini so bili izolirani iz celic BV2 ali eksosomov, pridobljenih iz BV2.Vzorci beljakovin se med celicami in eksosomi razlikujejo.(B) Western blot analiza eksosomskega markerja (Alix).(C) Vrednotenje prečiščene RNA iz celic BV2 in eksosomov, pridobljenih iz BV2, z uporabo bioanalizatorja.Tako so ribosomske podenote 18S in 28S v celicah BV2 redko našli v eksosomski RNA.(D) Transmisijska elektronska mikroskopija je pokazala, da so bili eksosomi, izolirani iz celic BV2, negativno obarvani z 2% uranil acetatom.Eksosomi so veliki približno 60-150 nm in v obliki skodelice (Song in Jung, neobjavljeni podatki).
S konfokalno mikroskopijo so opazili celično internalizacijo eksosomov, pridobljenih iz BV2, v celice človeškega glioma U87.Eksosomi, označeni s PKH26, so lokalizirani v citoplazmi celic U87.Jedra so bila obarvana z DAPI (slika 2A), kar kaže, da lahko eksosome, pridobljene iz BV2, internalizirajo gostiteljske celice in vplivajo na okolje prejemnih celic.
Internalizacija eksosomov, pridobljenih iz BV2, v celice glioma U87 in eksosomov, pridobljenih iz BV2, okuženih s toksoplazmo RH, je povzročila proliferacijo celic glioma U87.(A) Eksosomi, zajeti s celicami U87, merjeni s konfokalno mikroskopijo.Celice glioma U87 so bile 24 ur inkubirane z eksosomi, označenimi s PKH26 (rdeče) ali brez kontrole.Jedra smo obarvali z DAPI (modro) in jih nato opazovali pod konfokalnim mikroskopom (lestvica: 10 μm, x 3000).(B) Proliferacijo celic glioma U87 smo določili s testom celične proliferacije.Celice glioma U87 smo zdravili z eksosomi za navedeni čas. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t testom. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t testom. *P < 0,05 pridobljeno po t-kriteriju Stjudenta. *P < 0,05 s Studentovim t-testom. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P < 0,05, pridobljeno s pomočjo t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 pridobljeno s Studentovim t-testom.
Po potrditvi internalizacije eksosomov, pridobljenih iz BV2, v celice glioma U87, smo izvedli teste celične proliferacije, da bi raziskali vlogo eksosomov, pridobljenih iz toksoplazme, pridobljenih iz BV2, pri razvoju celic človeškega glioma.Zdravljenje celic U87 z eksosomi iz celic BV2, okuženih s T. gondii, je pokazalo, da so eksosomi, pridobljeni iz BV2, okuženi s T. gondii, povzročili znatno večjo proliferacijo celic U87 v primerjavi s kontrolo (slika 2B).
Poleg tega je imela rast celic U118 enake rezultate kot U87, saj so eksosomi, stimulirani s toksoplazmo, povzročili najvišjo stopnjo proliferacije (podatki niso prikazani).Na podlagi teh podatkov lahko pokažemo, da imajo eksosomi, okuženi s toksoplazmo, pridobljeni iz BV2, pomembno vlogo pri proliferaciji celic glioma.
Da bi raziskali učinek eksosomov, pridobljenih iz BV2, okuženih s toksoplazmo, na razvoj tumorja, smo celice glioma U87 injicirali v gole miši za model ksenotransplantata in injicirali eksosome, ki izvirajo iz BV2, ali eksosome, ki izvirajo iz BV2, okužene z RH.Ko so tumorji postali očitni po 1 tednu, so vsako poskusno skupino 5 miši razdelili glede na velikost tumorja, da bi določili isto izhodiščno točko, in velikost tumorja merili 22 dni.
Pri miših z modelom ksenotransplantata U87 so 22. dan opazili znatno večjo velikost in težo tumorja v skupini eksosomov, okuženih z RH, pridobljenimi z BV2 (sl. 3A, B).Po drugi strani pa ni bilo pomembne razlike v velikosti tumorja med skupino eksosomov, pridobljenih iz BV2, in kontrolno skupino po zdravljenju z eksosomi.Poleg tega so miši, ki so jim vbrizgali gliomske celice in eksosome, vizualno prikazale največji volumen tumorja v skupini z RH okuženih eksosomov, pridobljenih z BV2 (slika 3C).Ti rezultati kažejo, da eksosomi, okuženi s toksoplazmo, pridobljeni iz BV2, povzročijo rast glioma v modelu mišjega tumorja.
Onkogeneza (AC) eksosomov, pridobljenih iz BV2, v mišjem modelu ksenotransplantata U87.Velikost tumorja (A) in teža (B) sta se znatno povečali pri golih miših BALB/c, zdravljenih z eksosomi, okuženimi z RH, pridobljenimi iz BV2.Golim mišim BALB/c (C) smo subkutano injicirali 1 x 107 celic U87, suspendiranih v mešanici Matrigel.Šest dni po injiciranju smo mišim dali 100 μg eksosomov, pridobljenih iz BV2.Velikost in teža tumorja sta bili izmerjeni na navedene dni oziroma po žrtvovanju. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Podatki so pokazali, da je bilo 37 miRNA (16 čezmerno izraženih in 21 znižanih), povezanih z imunostjo ali razvojem tumorja, znatno spremenjenih v mikroglijah po okužbi s sevom Toxoplasma RH (slika 4A).Relativne ravni izražanja miR-21 med spremenjenimi miRNA so bile potrjene z RT-PCR v realnem času v eksosomih, pridobljenih iz BV2, eksosomih, zdravljenih s celicami BV2 in U87.Izražanje miR-21 je pokazalo znatno povečanje eksosomov iz celic BV2, okuženih s Toxoplasma gondii (sev RH) (slika 4B).Relativne ravni izražanja miR-21 v celicah BV2 in U87 so se povečale po prevzemu spremenjenih eksosomov (slika 4B).Relativne ravni izražanja miR-21 v možganskih tkivih bolnikov s tumorjem in miši, okuženih s Toxoplasma gondii (sev ME49), so bile višje kot pri kontrolah (slika 4C).Ti rezultati so v korelaciji z razlikami med nivoji izražanja predvidenih in potrjenih mikroRNA in vitro in in vivo.
Spremembe v izražanju eksosomskega miP-21a-5p v mikrogliji, okuženi s Toxoplasma gondii (RH).(A) Prikazuje pomembne spremembe siRNA, povezane z imunostjo ali razvojem tumorja po okužbi s T. gondii RH.(B) Relativne ravni ekspresije miR-21 so bile odkrite z RT-PCR v realnem času v eksosomih, pridobljenih z BV2, eksosomih, obdelanih z BV2, in celicah U87.(C) Relativne ravni izražanja miR-21 so bile ugotovljene v možganskih tkivih bolnikov s tumorjem (N=3) in miši, okuženih s Toxoplasma gondii (sev ME49) (N=3). *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t testom. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t testom. *P < 0,05 je bilo pridobljeno s pomočjo t-kriterija Stjudenta. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t-testom. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, pridobljeno s pomočjo t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 pridobljeno s Studentovim t-testom.
Eksosomi iz celic BV2, okuženih z RH, so povzročili rast gliomov in vivo in in vitro (sl. 2, 3).Za odkrivanje ustreznih mRNA smo pregledali ravni mRNA protitumorskih ciljnih genov, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN in programirano celično smrt 4 (PDCD4) v celicah U87, okuženih z eksosomi, pridobljenimi iz BV2 ali RH BV2.Bioinformatska analiza je pokazala, da ima več genov, povezanih s tumorjem, vključno z geni FoxO1, PTEN in PDCD4, vezavna mesta miR-2121,22.Ravni mRNA protitumorskih ciljnih genov so bile zmanjšane v eksosomih, ki izvirajo iz BV2, okuženih z RH, v primerjavi z eksosomi, ki izvirajo iz BV2 (slika 5A).FoxO1 je pokazal znižane ravni beljakovin v eksosomih, ki izvirajo iz BV2, okuženih z RH, v primerjavi z eksosomi, ki izvirajo iz BV2 (slika 5B).Na podlagi teh rezultatov lahko potrdimo, da eksosomi, pridobljeni iz BV2, okuženega z RH, uravnavajo antionkogene gene in ohranjajo svojo vlogo pri rasti tumorja.
Eksosomi, pridobljeni iz BV2, okuženi s toksoplazmo RH, inducirajo supresijo protitumorskih genov v celicah glioma U87 z eksosomi, okuženimi z BV2, okuženimi s toksoplazmo RH.(A) PCR v realnem času izražanja FoxO1, PTEN in PDCD4 v eksosomih, pridobljenih iz BV2, okuženega s T. gondii RH, v primerjavi z eksosomi PBS.Kot kontrolo smo uporabili mRNA β-aktina.(B) Ekspresija FoxO1 je bila določena z Western blottingom, podatki o denzitometriji pa so bili statistično ovrednoteni s programom ImageJ. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t testom. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t testom. *P < 0,05 je bilo pridobljeno s pomočjo t-kriterija Stjudenta. *P <0,05 je bilo pridobljeno s Studentovim t-testom. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, pridobljeno s pomočjo t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 pridobljeno s Studentovim t-testom.
Da bi razumeli učinek miP-21 v eksosomih na regulacijo genov, povezanih s tumorjem, smo celice U87 transficirali z zaviralcem miP-21 z uporabo Lipofectamine 2000 in celice pobrali 24 ur po transfekciji.Ravni izražanja FoxO1 in p27 v celicah, transficiranih z zaviralci miR-21, so primerjali s celicami, zdravljenimi z eksosomi, pridobljenimi iz BV2, z uporabo qRT-PCR (sl. 6A, B).Transfekcija zaviralca miR-21 v celice U87 je znatno znižala ekspresijo FoxO1 in p27 (slika 6).
Eksosomalni miP-21, pridobljen z RH, je spremenil izražanje FoxO1/p27 v celicah glioma U87.Celice U87 smo transficirali z zaviralcem miP-21 z uporabo Lipofectamine 2000 in celice pobrali 24 ur po transfekciji.Ravni izražanja FoxO1 in p27 v celicah, transficiranih z zaviralci miR-21, so primerjali z nivoji v celicah, zdravljenih z eksosomi, pridobljenimi iz BV2, z uporabo qRT-PCR (A, B).
Da bi se izognil gostiteljevemu imunskemu odzivu, se parazit toksoplazma spremeni v tkivno cisto.Parazitirajo na različnih tkivih, vključno z možgani, srcem in skeletnimi mišicami, skozi celotno življenje gostitelja in modulirajo gostiteljev imunski odziv.Poleg tega lahko uravnavajo celični cikel in apoptozo gostiteljskih celic, kar spodbuja njihovo proliferacijo 14, 24.Toxoplasma gondii pretežno okuži gostiteljske dendritične celice, nevtrofilce in monocitno/makrofagno linijo, vključno z možgansko mikroglijo.Toxoplasma gondii inducira diferenciacijo makrofagov fenotipa M2, vpliva na celjenje ran po okužbi s patogenom in je povezana tudi s hipervaskularizacijo in granulomatozno fibrozo.Ta vedenjska patogeneza okužbe s toksoplazmo je lahko povezana z markerji, povezanimi z razvojem tumorja.Sovražno okolje, ki ga uravnava toksoplazma, je lahko podobno ustreznemu predraku.Zato lahko domnevamo, da naj bi okužba s toksoplazmo prispevala k razvoju možganskih tumorjev.Pravzaprav so poročali o visokih stopnjah okužbe s toksoplazmo v serumu bolnikov z različnimi možganskimi tumorji.Poleg tega je lahko Toxoplasma gondii še en rakotvorni efektor in deluje sinergistično in pomaga drugim nalezljivim rakotvornim snovem pri razvoju možganskih tumorjev.V zvezi s tem velja omeniti, da P. falciparum in virus Epstein-Barr sinergistično prispevata k nastanku Burkittovega limfoma.
Vloga eksosomov kot regulatorjev na področju raziskav raka je bila obsežno raziskana.Vendar je vloga eksosomov med paraziti in okuženimi gostitelji še vedno slabo razumljena.Doslej so različni regulatorji, vključno z izločenimi beljakovinami, razložili biološke procese, s katerimi se protozojski paraziti upirajo napadom gostitelja in ohranjajo okužbo.V zadnjem času je vse bolj razširjen koncept, da mikrovezikli, povezani s praživalimi, in njihove mikroRNA medsebojno delujejo z gostiteljskimi celicami, da ustvarijo ugodno okolje za njihovo preživetje.Zato so potrebne nadaljnje študije, da bi odkrili razmerje med spremenjenimi eksosomskimi miRNA in proliferacijo celic glioma.Sprememba mikroRNA (skupina genov miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 in miR-17-92) se veže na promotor STAT3 v človeških makrofagih, okuženih s toksoplazmo, je regulirana in inducira anti -apoptoza kot odgovor na okužbo s Toxoplasma gondii 29 .Okužba s toksoplazmo poveča izražanje miR-17-5p in miR-106b-5p, ki sta povezana z več hiperproliferativnimi boleznimi 30 .Ti podatki kažejo, da so gostiteljske miRNA, ki jih uravnava okužba s toksoplazmo, pomembne molekule za preživetje parazita in patogenezo v biološkem vedenju gostitelja.
Spremenjene miRNA lahko vplivajo na različne vrste vedenja med iniciacijo in napredovanjem malignih celic, vključno z gliomi: samozadostnost signalov rasti, neobčutljivost na signale, ki zavirajo rast, izogibanje apoptozi, neomejen replikativni potencial, angiogeneza, invazija in metastaze ter vnetje.Pri gliomu so bile v več študijah profiliranja izražanja ugotovljene spremenjene miRNA.
V tej študiji smo potrdili visoke ravni izražanja miRNA-21 v gostiteljskih celicah, okuženih s toksoplazmo.miR-21 je bil identificiran kot ena najpogosteje prekomerno izraženih mikroRNA v solidnih tumorjih, vključno z gliomi, 33 in njegova ekspresija je v korelaciji s stopnjo glioma.Kopičenje dokazov kaže, da je miR-21 nov onkogen, ki deluje kot anti-apoptotični dejavnik pri rasti glioma in je močno prekomerno izražen v tkivih in plazmi malignih obolenj človeških možganov.Zanimivo je, da inaktivacija miR-21 v celicah in tkivih glioma sproži inhibicijo celične proliferacije zaradi od kaspaze odvisne apoptoze.Bioinformatska analiza predvidenih tarč miR-21 je razkrila več tumorskih supresorskih genov, povezanih s potmi apoptoze, vključno s programirano celično smrtjo 4 (PDCD4), tropomiozinom (TPM1), PTEN in forkhead box O1 (FoxO1), z mestom vezave miR-2121..22.38.
FoxO1 kot eden izmed transkripcijskih faktorjev (FoxO) sodeluje pri razvoju različnih vrst raka pri ljudeh in lahko uravnava izražanje tumor supresorskih genov, kot so p21, p27, Bim in FasL40.FoxO1 lahko veže in aktivira zaviralce celičnega cikla, kot je p27, da zavre rast celic.Poleg tega je FoxO1 ključni efektor signalizacije PI3K/Akt in uravnava številne biološke procese, kot sta napredovanje celičnega cikla in diferenciacija celic z aktivacijo transkripcije p2742.
Na koncu verjamemo, da lahko eksosomski miR-21, pridobljen iz mikroglije, okužene s toksoplazmo, igra pomembno vlogo kot regulator rasti celic glioma (slika 7).Vendar so potrebne nadaljnje študije, da bi našli neposredno povezavo med eksosomskim miR-21, spremenjeno okužbo s toksoplazmo in rastjo glioma.Pričakuje se, da bodo ti rezultati zagotovili izhodišče za preučevanje povezave med okužbo s toksoplazmo in pojavnostjo glioma.
V tej študiji je predlagan shematski diagram mehanizma karcinogeneze glioma (možganov).Avtor riše v programu PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Vsi eksperimentalni protokoli v tej študiji, vključno z uporabo živali, so bili v skladu s standardnimi etičnimi smernicami Odbora za oskrbo živali in uporabnike Nacionalne univerze v Seulu in odobril jih je institucionalni revizijski odbor Medicinske fakultete Nacionalne univerze v Seulu (številka IRB SNU- 150715).-2).Vsi eksperimentalni postopki so bili izvedeni v skladu s priporočili ARRIVE.
Mišje mikroglije BV2 in celice človeškega glioma U87 smo gojili v Dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (DMEM; Welgene, Seul, Koreja) oziroma v mediju Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), pri čemer je vsak vseboval 10 % fetalnega govejega seruma, 4 mM l- glutamina, 0,2 mM penicilina in 0,05 mM streptomicina.Celice smo gojili v inkubatorju s 5 % CO2 pri 37 °C.Druga celična linija glioma, U118, je bila uporabljena za primerjavo s celicami U87.
Za izolacijo eksosomov iz sevov RH in ME49, okuženih s T. gondii, so tahizoite T. gondii (sev RH) pobrali iz trebušne votline 6-tedenskih miši BALB/c, ki so jim injicirali 3-4 dni prej.Tahizoite smo trikrat sprali s PBS in očistili s centrifugiranjem v 40% Percollu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA)43.Za pridobitev tahizoitov seva ME49 so miši BALB/c intraperitonealno injicirali 20 tkivnih cist in transformacijo tahizoitov v cistah zbrali z izpiranjem trebušne votline 6-8. dan po okužbi (PI).Miši, okužene s PBS.Tahizoite ME49 smo gojili v celicah, dopolnjenih s 100 μg/ml penicilina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, ZDA), 100 μg/ml streptomicina (Gibco/BRL) in 5 % fetalnega govejega seruma (Lonza, Walkersville, MD) .., ZDA) pri 37 °C in 5 % ogljikovega dioksida.Po gojenju v celicah Vero smo tahizoite ME49 dvakrat spustili skozi iglo velikosti 25 in nato skozi filter 5 µm, da smo odstranili ostanke in celice.Po izpiranju smo tahizoite resuspendirali v PBS44.Tkivne ciste Toxoplasma gondii seva ME49 so vzdrževali z intraperitonealno injekcijo cist, izoliranih iz možganov okuženih miši C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreja).Možgane miši, okuženih z ME49, smo pobrali po 3 mesecih PI in jih zdrobili pod mikroskopom, da smo izolirali ciste.Okužene miši so hranili v posebnih pogojih brez patogenov (SPF) na Medicinski fakulteti Nacionalne univerze v Seulu.
Celotno RNK smo ekstrahirali iz eksosomov, pridobljenih iz BV2, celic in tkiv BV2 z uporabo miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu z navodili proizvajalca, vključno s časom inkubacije za korak elucije.Koncentracijo RNA smo določili na spektrofotometru NanoDrop 2000.Kakovost RNA mikromrež je bila ocenjena z uporabo bioanalizatorja Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Nizozemska).
DMEM z 10 % eksosomsko revnega FBS smo pripravili z ultracentrifugiranjem pri 100.000 g 16 ur pri 4 °C in filtrirali skozi 0,22 µm filter (Nalgene, Rochester, NY, ZDA).Celice BV2, 5 × 105, smo gojili v DMEM, ki je vseboval 10 % eksosomsko osiromašenega FBS in 1 % antibiotikov pri 37 °C in 5 % CO2.Po 24 urah inkubacije smo celicam dodali tahizoite seva RH ali ME49 (MOI = 10) in v eni uri odstranili neinvazivne parazite ter jih ponovno napolnili z DMEM.Eksosome iz celic BV2 smo izolirali z modificiranim diferencialnim centrifugiranjem, ki je najbolj razširjena metoda.Peleto eksosoma ponovno suspendirajte v 300 µl PBS za analizo RNA ali beljakovin.Koncentracijo izoliranih eksosomov smo določili z uporabo kompleta za analizo beljakovin BCA (Pierce, Rockford, IL, ZDA) in spektrofotometra NanoDrop 2000.
Precipitate iz celic BV2 ali eksosome, pridobljene iz BV2, smo lizirali v raztopini za ekstrakcijo beljakovin PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Koreja) in proteine ​​naložili na Coomassie briljantno modro obarvane 10% SDS poliakrilamidne gele.Poleg tega so bili proteini preneseni na PVDF membrane za 2 uri.Western bloti so bili validirani z uporabo protitelesa Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ZDA) kot eksosomskega markerja.Kot sekundarno protitelo so uporabili kozji protimišji IgG (H + L), konjugiran s HRP (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, ZDA) in LAS-1000 plus luminiscentni analizator slike (Fuji Photographic Film, Tokio, Japonska)..Transmisijska elektronska mikroskopija je bila izvedena za preučevanje velikosti in morfologije eksosomov.Eksosome, izolirane iz celic BV2 (6,40 µg/µl), smo pripravili na mrežah, prevlečenih z ogljikom, in jih 1 minuto negativno obarvali z 2% uranil acetatom.Pripravljene vzorce smo opazovali pri pospeševalni napetosti 80 kV z uporabo JEOL 1200-EX II (Tokio, Japonska), opremljenega s ES1000W Erlangshen CCD kamero (Gatan, Pleasanton, CA, ZDA).
Eksosome, pridobljene iz BV2, smo obarvali z uporabo PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) 15 minut pri sobni temperaturi.Celice U87, 2 × 105, z eksosomi, označenimi s PKH26 (rdeče) ali brez eksosomov kot negativne kontrole, smo inkubirali pri 37 °C 24 ur v inkubatorju s 5 % CO2.Celična jedra U87 smo obarvali z DAPI (modro), celice U87 smo fiksirali v 4% paraformaldehidu 15 minut pri 4 °C in nato analizirali v sistemu konfokalnega mikroskopa Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Nemčija).opazen.
cDNA je bila sintetizirana iz siRNA z uporabo prve verige Mir-X siRNA in kompleta SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japonska).Kvantitativni PCR v realnem času je bil izveden z uporabo sistema za odkrivanje PCR v realnem času iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) z uporabo primerjev in predlog, pomešanih s SYBR Premix.DNK smo pomnožili za 40 ciklov denaturacije pri 95 °C za 15 s in žarjenja pri 60 °C za 60 s.Podatke iz vsake reakcije PCR smo analizirali z uporabo modula za analizo podatkov programske opreme optičnega sistema iQ™5 (Bio-Rad).Relativne spremembe v izražanju genov med izbranimi ciljnimi geni in β-aktinom/siRNA (in U6) so bile izračunane z metodo standardne krivulje.Uporabljena zaporedja primerjev so prikazana v tabeli 1.
3 x 104 celic glioma U87 smo zasejali v plošče s 96 vdolbinicami in zmešali z eksosomi, okuženimi s toksoplazmo, pridobljenimi iz BV2 (50 μg/mL) ali nepulznimi eksosomi, pridobljenimi iz BV2 (50 μg/mL), kot kontrole po 12, 18 in 36 urah. .Hitrost celične proliferacije je bila določena z uporabo kompleta za štetje celic-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska) (dodatne slike S1-S3) 46.
5-tedenske samice golih miši BALB/c so bile kupljene pri Orient Bio (Seongnam-si, Južna Koreja) in posamezno hranjene v sterilnih kletkah pri sobni temperaturi (22 ± 2 °C) in vlažnosti (45 ± 15 °C).%) pri sobni temperaturi (22±2°C) in vlažnosti (45±15%).12-urni svetlobni cikel in 12-urni temni cikel sta bila izvedena pod SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Miši smo naključno razdelili v tri skupine po 5 miši in vsem skupinam subkutano injicirali 400 ml PBS, ki je vseboval 1 x 107 gliomskih celic U87 in BD Matrigel™ z zmanjšanim rastnim faktorjem (BD Science, Miami, FL, ZDA).Šest dni po injiciranju tumorja je bilo na mesto tumorja injiciranih 200 mg eksosomov, pridobljenih iz celic BV2 (z/brez okužbe s toksoplazmo).Dvaindvajset dni po okužbi s tumorjem smo miši v vsaki skupini s kaliperjem merili velikost tumorja trikrat na teden in izračunali volumen tumorja po formuli: 0,5 × (širina) × 2 × dolžina.
Analiza ekspresije mikroRNA z uporabo niza miRNA miRCURYTM LNA, 7. generacija nizov mmu in rno (EXIQON, Vedbaek, Danska), ki zajema 1119 dobro označenih miši med 3100 sondami za zajemanje miRNA človeka, miši in podgan.Med tem postopkom je bilo od 250 do 1000 ng celotne RNA odstranjenih iz 5'-fosfata z obdelavo z alkalno fosfatazo telečjega črevesa, čemur je sledilo označevanje z zelenim fluorescenčnim barvilom Hy3.Označene vzorce smo nato hibridizirali z nalaganjem stekelcev mikromrež z uporabo kompleta hibridizacijske komore (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA) in kompleta hibridizacijskih stekelcev (Agilent Technologies).Hibridizacijo smo izvajali 16 ur pri 56 °C, nato smo mikromreže sprali v skladu s priporočili proizvajalca.Obdelana mikromrežna stekelca so bila nato skenirana s sistemom skenerja mikromrež Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Skenirane slike so bile uvožene z uporabo programske opreme Agilent Feature Extraction različice 10.7.3.1 (Agilent Technologies) in intenziteta fluorescence vsake slike je bila kvantificirana z uporabo ustrezne datoteke GAL spremenjenega protokola Exiqon.Podatki mikromrež za trenutno študijo so deponirani v bazi podatkov GEO pod pristopno številko GPL32397.
Ekspresijske profile zrelih eksosomskih miRNA v mikroglijah sevov RH ali ME49, okuženih s toksoplazmo, smo analizirali z uporabo različnih omrežnih orodij.miRNA, povezane z razvojem tumorja, so bile identificirane z uporabo miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) in filtrirane z normalizirano intenziteto signala (log2), večjo od 8,0.Med miRNA je bilo ugotovljeno, da so različno izražene miRNA več kot 1,5-krat spremenjene s filtrirno analizo miRNA, spremenjenih s sevi RH ali ME49, okuženimi s T. gondii.
Celice smo zasejali v plošče s šestimi jamicami (3 x 105 celic/jamico) v opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, ZDA) z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA).Transfektirane celice smo gojili 6 ur in nato medij spremenili v svež popolni medij.Celice smo pobrali 24 ur po transfekciji.
Statistična analiza je bila v glavnem izvedena z uporabo Studentovega t-testa s programsko opremo Excel (Microsoft, Washington, DC, ZDA).Za analizo poskusnih živali je bila izvedena dvosmerna ANOVA z uporabo programske opreme Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA). P-vrednosti < 0,05 so veljale za statistično pomembne. P-vrednosti < 0,05 so veljale za statistično pomembne. Vrednosti P <0,05 so se štele za statistično pomembne. Vrednosti P <0,05 so veljale za statistično pomembne. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Vrednosti P <0,05 so se štele za statistično pomembne. Vrednosti P <0,05 so veljale za statistično pomembne.
Vse eksperimentalne protokole, uporabljene v tej študiji, je odobril institucionalni revizijski odbor Medicinske fakultete Nacionalne univerze v Seulu (IRB številka SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Ocenjena svetovna incidenca in umrljivost zaradi raka v letu 2018: viri in metode GLOBOCAN.Tolmačenje.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Vpogled v dejavnike tveganja možganskih tumorjev in njihove terapevtske posege. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Vpogled v dejavnike tveganja možganskih tumorjev in njihove terapevtske posege.Rashid, S., Rehman, K. in Akash, MS Pregled dejavnikov tveganja za možganske tumorje in večjih terapevtskih posegov. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Globoko razumevanje dejavnikov tveganja za možganski tumor in terapevtskih posegov.Rashid, S., Rehman, K. in Akash, MS Pregled dejavnikov tveganja za možganske tumorje in večjih terapevtskih posegov.Biomedicinska znanost.farmacevt.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijske in virusne interakcije pri raku človeškega orodigestivnega in ženskega genitalnega trakta: Povzetek epidemioloških in laboratorijskih dokazov. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijske in virusne interakcije pri raku človeškega orodigestivnega in ženskega genitalnega trakta: Povzetek epidemioloških in laboratorijskih dokazov.Kato I., Zhang J. in Sun J. Bakterijske in virusne interakcije pri raku človeškega gastrointestinalnega trakta in ženskega genitalnega trakta: povzetek epidemioloških in laboratorijskih podatkov. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：流行病学和实　绻室证据怂 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virusna interakcija v prebavi človeške ustne votline in ženskem reproduktivnem traktu: povzetek popularne znanosti o boleznih in laboratorijskih dokazov.Kato I., Zhang J. in Sun J. Bakterijske in virusne interakcije pri raku prebavil pri človeku in raku ženskih spolnih organov: povzetek epidemioloških in laboratorijskih podatkov.Rak 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Od okužbe do raka: Kako tumorski virusi DNA spremenijo osrednjo presnovo ogljika in lipidov v gostiteljski celici. Magon, KL & Parish, JL Od okužbe do raka: Kako tumorski virusi DNA spremenijo osrednjo presnovo ogljika in lipidov v gostiteljski celici.Mahon, KL in Parish, JL Okužba z ognjem do raka: kako tumorski virusi na osnovi DNK spremenijo centralno presnovo ogljika in lipidov v gostiteljski celici. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Od okužbe do raka: kako tumorski virusi DNA spremenijo osrednjo presnovo ogljika in lipidov v gostiteljski celici.Mahon, KL in Parish, JL Okužba povzroči raka: kako tumorski virusi DNA spremenijo osrednjo presnovo ogljika in lipidov v gostiteljskih celicah.Odprta biologija.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Kateholni estrogeni shistosomov in jetrnih metljajev ter raka, povezanega s helminti.spredaj.vroče v notranjosti.5, 444 (2014).