Giardia duodenum je parazitski organizem, ki povzroča giardiozo, črevesno okužbo, ki je še posebej pogosta pri majhnih otrocih s kliničnimi znaki driske.Prej smo poročali, da zunajcelični G. duodenalis sproži aktivacijo intracelularnega oligomerizaciji podobnega receptorja 3 (NLRP3) vezavnih nukleotidov in uravnava vnetne odzive gostitelja prek izločanja zunajceličnih veziklov (EV).Vendar pa je treba natančne molekularne vzorce s patogenom povezanega duodenokoknega EV (GEV), vključenega v ta proces, in vlogo vnetja NLRP3 pri giardiji še pojasniti.
Rekombinantni evkariontski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 in alpha-7.3 giardini v GEV so bili konstruirani, transficirani v mišje primarne peritonealne makrofage in odkriti z merjenjem tarčne molekule vnetja kaspaze-1.Preverjena je bila raven izražanja p20..G. duodenalis alpha-2 in alpha-7.3 giardine so prvotno identificirali z merjenjem vnetja NLRP3 (NLRP3, pro-interlevkin-1 beta [IL-1β], pro-kaspaza-1 in kaspaza-1 p20), izločanje IL.ravni 1β, ravni oligomerizacije apoptotičnih pikčastih beljakovin (ASC) in imunofluorescentna lokalizacija NLRP3 in ASC.Vlogo vnetja NLRP3 pri patogenosti G. duodenalis smo nato ocenili z uporabo miši, pri katerih je bila aktivacija NLRP3 blokirana (miši, blokirane z NLRP3), in spremljali patološke spremembe v telesni teži, obremenitvi dvanajstnika s paraziti in dvanajstnem tkivu.Poleg tega smo raziskali, ali hiardini alfa-2 in alfa-7.3 inducirata izločanje IL-1β in vivo preko vnetja NLRP3 in določili vlogo teh molekul pri patogenosti G. duodenalis pri miših.
Giardini alfa-2 in alfa-7.3 inducirata aktivacijo inflamasoma NLRP3 in vitro.To je privedlo do aktivacije p20 kaspaze-1, povečanja ravni ekspresije proteinov NLRP3, pro-IL-1β in pro-kaspaze-1, znatnega povečanja izločanja IL-1β, nastanka madežev ASA v citoplazmi in indukcijo oligomerizacije ASA.Vnetje NLRP3 Izguba penisa poslabša patogenost G. duodenalis pri miših.Miši, zdravljene s cistami z gavažo miši, blokiranih z NLRP3, so pokazale povečano število trofozoitov in resne poškodbe duodenalnih resic, za katere so značilne nekrotične kripte s skrčenimi in razvejanimi.Poskusi in vivo so pokazali, da lahko giardini alfa-2 in alfa-7.3 inducirata izločanje IL-1β preko vnetja NLRP3, imunizacija z giardini alfa-2 in alfa-7.3 pa je zmanjšala patogenost G. duodenalis pri miših.
Rezultati te študije skupaj kažejo, da giardia alpha-2 in alpha-7.3 povzročata uravnavanje vnetja gostiteljskega NLRP3 in zmanjšujeta infektivnost G. duodenalis pri miših, ki sta obetavni tarči za preprečevanje giardiaze.
Giardia duodenum je zunajcelični protozojski parazit, ki živi v tankem črevesu in povzroči 280 milijonov primerov giardiaze z drisko letno, zlasti pri majhnih otrocih v državah v razvoju [1].Ljudje se okužimo s pitjem vode ali hrane, okužene s cistami M. duodenum, ki nato pridejo v želodec in se izločijo z želodčnim sokom.Trofozoiti Giardia duodenum se pritrdijo na epitelij dvanajstnika in povzročajo slabost, bruhanje, drisko, bolečine v trebuhu in izgubo teže.Posamezniki z imunsko pomanjkljivostjo in cistično fibrozo so dovzetni za okužbo.Do okužbe lahko pride tudi pri oralnem in analnem seksu [2].Zdravila, kot so metronidazol, tinidazol in nitazoksanid, so prednostne možnosti zdravljenja okužb dvanajstnika [3].Vendar pa ta zdravila za kemoterapijo povzročajo neželene stranske učinke, kot so slabost, karcinogeneza in genotoksičnost [4].Zato je treba razviti učinkovitejše strategije za preprečevanje okužbe z G. duodenalis.
Inflamasomi so razred citosolnih proteinskih kompleksov, ki so del prirojenega imunskega odziva, pomagajo pri obrambi pred invazijo patogenov in posredujejo pri vnetnih odzivih [5].Med temi vnetji so obsežno raziskali nukleotidno vezavni oligomerizacijski (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotidno vezavni oligomerizacijski (NLRP3) nukleotidni vezavi podoben vnetje, ker ga je mogoče zaznati z različnimi molekularnimi vzorci, povezanimi s patogeni/poškodbami (PAMP/ DAMP), prepozna, aktivira prirojeni imunski sistem.in uravnava črevesno homeostazo pri številnih vnetnih boleznih [6,7,8].Sestavljen je iz receptorja za prepoznavanje vzorcev (PRR) NLRP3, adapterskega apoptotičnega pikastega proteina (ASC) in efektorja prokaspaze-1 ali prokaspaze-11.Inflammasom NLRP3 deluje kot gostitelj proti invaziji patogenov, kot so opazili v študijah Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] in Leishmania.[11], poročali pa so tudi, da aktivacija inflamasoma NLRP3 omejuje zaščitne imunske odzive in poslabša napredovanje bolezni, na primer pri črvih [12].Na podlagi naših prejšnjih ugotovitev smo poročali, da zunajcelični G. duodenalis sproži znotrajcelično aktivacijo vnetja NLRP3 in modulira vnetne odzive gostitelja z izločanjem zunajceličnih veziklov (EV) [13].Vendar je treba vlogo vnetja NLRP3 pri okužbi z G. duodenalis in vivo še določiti.
Giardini so bili prvotno opisani kot strukturne komponente citoskeleta G. duodenalis in igrajo pomembno vlogo pri gibljivosti trofozoitov in pritrjevanju epitelijskih celic v tankem črevesu.Da bi se bolje prilagodili okolju in povečali svojo patogenost, so trofozoiti G. duodenalis razvili edinstveno citoskeletno strukturo, sestavljeno iz 8 flagel, 1 srednjega telesa in 1 ventralnega diska [14].Trofozoiti Giardia duodenum uporabljajo svoj citoskelet, da prodrejo v zgornji del tankega črevesa, zlasti v dvanajstnik, in se pritrdijo na enterocite.Nenehno migrirajo in se pritrdijo na epitelne celice s pomočjo celičnega metabolizma.Zato obstaja tesna povezava med njihovim citoskeletom in virulenco.Giardine, specifične za Giardia duodenum, so komponente strukture citoskeleta [15] in so razdeljene v štiri razrede: α-, β-, γ- in δ-giardine.Obstaja 21 članov družine α-giardinov, od katerih imajo vsi od kalcija odvisno sposobnost vezave fosfolipidov [16].Prav tako povezujejo citoskelet s celično membrano.Pri posameznikih z drisko, ki jo povzroča G. duodenalis, so α-giardini med okužbo močno izraženi in imunoreaktivni [17].Heterologna cepiva na osnovi Giardia alfa-1 ščitijo pred giardiozo pri miših in so potencialni kandidatni antigeni za razvoj cepiva [18].Alfa-8 giardin, lokaliziran v plazemski membrani in bičkih, ne pa v ventralnem disku, poveča gibljivost in stopnjo rasti trofozoitov v G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin se pritrdi na mikrotubulne strukture na bičkih in vpliva na sposobnost preživetja G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine je prisoten v izobilju v celotnem življenjskem ciklu in prekomerna ekspresija alpha-11 giardine poškoduje samo G. duodenalis [21].Vendar pa ni jasno, ali alfa-2 giardin in alfa-7.3 giardin ščitita pred okužbo z G. duodenalis in njunimi osnovnimi mehanizmi.
V tej študiji so rekombinantna evkariontska ekspresijska plazmida pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine in pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine transfektirali v mišje primarne peritonealne makrofage, da aktivirajo gostiteljski NLRP3.Inflammasomske tarče so bile nato pregledane.Ocenili smo tudi vlogo vnetja NLRP3 pri patogenosti G. duodenalis, raziskali, ali alfa-2 in alfa-7,3 giardini inducirata aktivacijo vnetja NLRP3 in vivo, in ugotovili, da ti dve vlogi giardin pri patogenosti G. duodenalis.Naš skupni cilj je bil razviti obetavne cilje za preprečevanje okužbe z G. duodenalis.
Samice miši divjega tipa (WT) C57BL/6, stare 5–8 tednov, so bile kupljene pri Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kitajska).Miši so imele prost dostop do vode, prejemale so sterilizirano hrano in bile v 12/12-urnem ciklu svetloba/tema.Pred okužbo so miši prejele antibiotike ad libitum v pitni vodi z dodatkom ampicilina (1 mg/mL), vankomicina (1 mg/mL) in neomicina (1,4 mg/mL) (vsi kupljeni v Šanghaju na Kitajskem, umetni organizmi) [ 22 ].].Miši, ki so izgubile sposobnost jesti in piti za > 24 ur in so izgubile ≥ 20 % telesne teže, so bile humano evtanazirane z izpahom materničnega vratu.
Trofozoiti WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, ZDA) so bili dopolnjeni z 12,5 % fetalnega govejega seruma (FBS; Every Green, Zhejiang, Kitajska) in 0,1 % govejega žolča (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ZDA). ).ZDA) v mikroaerobnih pogojih.Konfluentne trofozoite smo zbrali na ledu in pasirali v razmerju 1:4 za nadaljnjo reprodukcijo.
Ciste Giardia duodenum so bile inducirane, kot je opisano prej [23], trofozoiti so bili pobrani v logaritemski fazi in nato razredčeni z medijem za induciranje inkapsulacije, pH 7,1 (modificiran TYI-S-33) do končne koncentracije 1 × 106 trofozoitov/mL.koncentracija žolča 0,05 % medij).Trofozoite smo gojili v anaerobnih pogojih pri 37 °C do faze logaritemske rasti.Spremenite gojišče v medij za induciranje cist (pH 7,8; ​​modificirano gojišče TYI-S-33 z 1 % koncentracijo žolča) in gojite G. duodenalis pri 37 °C 48–96 ur, med tem pa pod mikroskopom opazujte nastajajoče ciste.Potem ko je bila večina trofozoitov inducirana, da tvorijo ciste, je bila zmes kulture pobrana in resuspendirana v sterilni deionizirani vodi, da se lizirajo preostali trofozoiti.Ciste smo prešteli in shranili pri 4 °C za nadaljnje analize skozi želodčno cevko pri miših.
Zunajcelični vezikli Giardia (GEV) so bili obogateni, kot je opisano prej [13].Trofozoite v logaritemski fazi rasti smo resuspendirali v modificiranem mediju TYI-S-33, pripravljenem z eksosomsko osiromašenim FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) do končne koncentracije 1 × 106 parazitov/mL in inkubirali 12 ur.izolirali iz supernatanta kulture s centrifugiranjem pri 2000 g 10 minut, 10.000 g 45 minut in 100.000 g 60 minut.Oborine smo raztopili v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS), kvantificirali z uporabo kompleta za testiranje beljakovin BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) in shranili pri -80 °C ali neposredno uporabili za nadaljnje analize.
Primarni mišji peritonealni makrofagi so bili pripravljeni, kot je opisano prej [24].Na kratko, miši (stare 6-8 tednov) smo injicirali (intraperitonealno [ip]) z 2,5 ml 2,98% Difco tekočega tioglikolnega medija (BD, Franklin Lakes, NJ, ZDA) in hranili 3-4 nepca.Suspenzijo makrofagov smo zbrali iz trebušne votline miši po evtanaziji in centrifugirali 3-krat pri 1000 g 10 minut.Pobrane celice so bile odkrite s pretočno citometrijo z uporabo markerja CD11b, dokler ni bila čistost celic > 98 %, nato dodane na plošče s 6 vdolbinicami za celične kulture (4,5 x 106 celic/vdolbinico) in inkubirane z 10 % FBS (Bioindustry) pri 37 °C.in 5 % CO2.
RNA je bila ekstrahirana iz 1 × 107 trofozoitov v 1 ml reagenta TRIzol (Vazyme, Nanjing, Kitajska), genomska DNA je bila ekstrahirana iz celotne G. duodenalis RNA z uporabo MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kitajska) in sintetizirana komplementarna DNA (cDNA). z uporabo MonScript RTIIII Super Mix (Monad) v skladu z navodili proizvajalca.
Informacije o zaporedju CDS za ciljni gen G. duodenalis so bile pridobljene iz NCBI GenBank.Uporabite Primer 5.0 za oblikovanje specifičnih primerjev za brezšivno kloniranje za vsak ciljni gen.Prednji primer (5′-3′) je sestavljen iz treh delov: prekrivajočega se zaporedja z lineariziranim vektorjem pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) in začetnih kodonov ATG in GNN (če prva baza ni G).To se naredi za izboljšanje učinkovitosti izražanja.Poleg tega vsaj 16 bp kombiniranih baz (vsebnost GC 40–60 %/Tm pribl. 55 °C).Reverzni primer (5'-3') je sestavljen iz dveh delov, prekrivajočega se zaporedja z EcoRV-lineariziranim vektorjem pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) in kombinirane baze vsaj 16 bp.(brez zadnjih dveh postankov).baze) kodon, kot je AA ali GA, ki omogoča rekombinantnim plazmidom izražanje njihovih označenih proteinov).Sekvence primerjev so navedene v tabeli 1 in jih je sintetiziral Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kitajska).
Tarče so bile pomnožene z uporabo Pfu DNA polimeraze (Tiangen, Peking, Kitajska) ali Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kitajska) z uporabo pripravljene cDNA G. duodenalis kot predloge.Plazmid evkariontskega ekspresijskega vektorja pcDNA3.1(+) je bil lineariziran z restrikcijskim encimom EcoRV in defosforiliran z uporabo Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizirane fragmente pcDNA3.1(+) in pomnožene fragmente ciljnega gena smo očistili z uporabo kompleta za čiščenje DNA gela (Tiangen) in kvantificirali z uporabo Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragment pcDNA3.1(+) in vsak fragment ciljnega gena sta bila rekombinirana z uporabo mešanice za kloniranje z eno sestavo MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kitajska) in potrjena s sekvenciranjem DNK z uporabo Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kitajska)..
Plazmida brez endotoksina pcDNA3.1(+)-alpha-2 in pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 sta bila ustvarjena z uporabo mini kompleta SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Koncentracijo smo vzdrževali nad 500 ng/µl, da zagotovimo, da EDTA v elucijskem pufru ne moti transfekcijskega testa.Primarne mišje peritonealne makrofage smo gojili v ploščah s 6 vdolbinicami s popolnim medijem RPMI 1640 (Biological Industries) 12 ur, nato smo celice 3-krat sprali v toplem PBS, da smo odstranili penicilin in streptomicin, in nato v mediju, dopolnjenem s popolnim medijem.Plazmida brez endotoksina pcDNA3.1(+)-alpha-2 in pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) smo razredčili v 125 μl Opti-MEM reduciranega serumskega medija (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Nato smo 5 µl transfekcijskega reagenta Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) razredčili v 125 µl medija z nizko vsebnostjo seruma Opti-MEM.Pripravite komplekse liposom-DNA z mešanjem razredčenega plazmida brez endotoksinov z Lipofectamine 2000 in pustite mešanico stati pri sobni temperaturi 5 minut.Komplekse ločeno prenesite v celice v vsaki vdolbinici in počasi premešajte.Po 4 urah smo gojišče celične kulture zamenjali z 2 ml popolnega medija RPMI 1640 in gojenje nadaljevali 24 ur.Celicam smo dodali svež medij celične kulture in ga inkubirali v različnih časovnih točkah, odvisno od zasnove testa.
Vzorci beljakovin iz supernatantov in celičnih lizatov so bili pripravljeni, kot je opisano prej [25].Parametri membranskega prenosa za pro-IL-1β, pro-kaspazo-1, kaspazo-1 p20, NLRP3, β-aktin in His-tag so bili 200 mA/90 min.Za interlevkin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, ZDA), kaspazo-1 (p20) (Adipogen, Švica) in NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Švica) in 1:5000, ki cilja na oznako His (Amylet Scientific, Wuhan, Kitajska) in β-aktin (Proteintech, Wuhan, Kitajska).
Navzkrižno povezovanje z disukcinimid suberatom (DSS) je bilo izvedeno, kot je opisano prej [26].Celice smo 3-krat sprali s hladnim PBS in popolnoma lizirali z iglo velikosti 27 v 50 µl ASC reakcijskega pufra (pH 8,0), ki je vseboval 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES in 125 mM NaHCO3.Zmes centrifugiramo pri 5000 g 3 minute in peleto zašijemo z 10 µl DSS (25 mM v DMSO) in 40 µl ASC reakcijskega pufra 30 minut pri 37 °C.Po 10-minutnem centrifugiranju pri 5000 g smo peleto raztopili v raztopini 40 µl reakcijskega pufra ASC in 10 µl pufra za nalaganje 6x beljakovin (TransGen, Peking, Kitajska), nato pa smo raztopino pogasili pri sobni temperaturi 15 minut. min., Nato kuhajte 10 minut.Vzorce beljakovin smo nato izpostavili Western blottingu z uporabo primarnih protiteles proti ASC (Wanleibio, Shenyang, Kitajska) v razmerju redčenja 1:500.
Po prej opisanem postopku [13] smo zbrali supernatante celične kulture in določili izločanje provnetnega citokina IL-1β z uporabo kompleta mišjega IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Pretvorite vrednosti OD450nm v koncentracije beljakovin z uporabo standardne krivulje IL-1β.
Celice, prekrite s pokrovnimi stekelci, so bile 3-krat nežno sprane v toplem PBS, fiksirane v fiksativu za tkivne celice (Biosharp, Peking, Kitajska) 10 minut pri sobni temperaturi (RT), v 0,1 % Triton X-Permeabilize pri 100 (razredčeno v PBS; Biosharp ) 20 minut pri sobni temperaturi in blokirajte v 5 % govejem serumskem albuminu (v PBS) 2 uri pri sobni temperaturi.Celice smo nato čez noč inkubirali pri 4 °C s primarnimi protitelesi proti ASC (razredčenje 1:100) oziroma NLRP3 (razredčenje 1:100) in s Cy3 označenim kozjim anti-kunčjim IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, ZDA) ali s FITC konjugiranim kozjim protimišjim IgG (1:400; Earthox) čez noč pri 37 °C v temi 1 uro.Jedra smo 5 minut obarvali s Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kitajska) in opazovali pod fluorescenčnim mikroskopom (Olympus Corporation, Tokio, Japonska).
Miši so bile razdeljene v štiri skupine (n = 7 v vsaki skupini): (i) negativna kontrolna skupina, zdravljena s PBS (samo PBS; gavaža 100 µl/miš PBS, ki ji sledi dnevna intraperitonealna injekcija 100 µl/miš PBS 3 ure kasneje)., neprekinjeno 7 dni);(ii) negativna kontrolna skupina, zdravljena z zaviralcem MCC950 [27] (100 µl/miš preko PBS gavaže, 3 ure kasneje, 10 mg/kg telesne mase [TM] MCC950 [v PBS] smo dajali intraperitonealno dnevno, trajanje 7 dni);(iii) skupina okužbe s cisto G. duodenalis (1,5 x 106 cist/miš z gavažo, 3 ure kasneje, 100 μl/miš PBS intraperitonealno dano dnevno 7 dni);(iv) Skupina kombinirane okužbe s cisto G. duodenalis Skupina za zdravljenje z zaviralcem MCC950 (1,5 × 106 cist/miš z gavažo, 10 mg/kg telesne teže MCC950 intraperitonealno dnevno 7 dni po 3 ure).Telesno težo vsake miši smo spremljali dnevno in vse miši evtanazirali 7. dan.Pobrani dvanajstnik (3 cm dolg) smo razrezali na majhne koščke v 1 ml PBS, ciste smo uničili čez noč v PBS pri 4 °C in G. duodenalis trofozoite.Svež dvanajstnik (1 cm dolg) je bil izoliran za barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E).
Miši smo razdelili v dve skupini: (i) kontrolno skupino MOCK in (ii) skupino inhibitorjev MCC950.V vsaki skupini je bilo pet zdravljenj (n = 7/zdravljeno skupino): (i) negativna kontrolna skupina, zdravljena s PBS (samo PBS; 100 µl/miš PBS, intramuskularna (IM) injekcija (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmidna negativna kontrolna skupina (100 µg/mišjo DNA, preko intramuskularne injekcije); skupina, zdravljena s plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 µg/mišjo DNA, z intramuskularno injekcijo), in (v) skupina, zdravljena s plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/miš DNA, po 12 urah pasaže so miši v skupini z zaviralcem MCC950 prejemale dnevno intraperitonealno injekcijo MCC950 (10 mg/kg telesne teže) 7 dni, medtem ko so miši v skupini MOCK prejemale enako količino zdravljenja s PBS. Vzorci krvi so zbrali iz očesnih zrkel miši in jih pustili čez noč pri 4 °C. Vzorce seruma smo izolirali z uporabo encimsko vezanega imunskega testa (ELISA) za in meritve ravni IL-1β.
Petintrideset miši je bilo razdeljenih v pet skupin (n=7/skupino).Skupina 1 je bila negativna kontrolna skupina, zdravljena s PBS: miši so prejele 100 μl PBS intramuskularno in 3 dni kasneje z gavažo.Skupina 2 je pozitivna kontrolna skupina, okužena s cistami G. duodenalis: miši smo injicirali 100 μl PBS in 3 dni kasneje intragastrično injicirali 1,5 x 106 cist/miš.Tretja skupina – plazmidna imunizacija s pcDNA3.1(+) v kombinaciji s kontrolno skupino za okužbo s cisto na dvanajstniku: miši so prejele 100 μg plazmidne DNA pcDNA3.1(+)(im) peroralno, 1,5×106 cist/miš 3 večkrat. dnevi.Skupini 4 in 5 sta bili rekombinantni plazmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ali plazmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine v kombinaciji z okužbo s cisto G. duodenalis.Eksperimentalna skupina: miši so prejele 100 µg pcDNA3.1(+)-giardinove plazmidne DNA (im), nato pa 3 dni kasneje z gavažo injicirali 1, 5 × 106 cist/miš.Telesno težo vsake miši smo spremljali po vnosu ciste G. duodenalis skozi cev.Svež dvanajstnik je bil zbran za meritve parazitske obremenitve in analizo obarvanja s HE.
Histopatološke spremembe so bile analizirane po predhodno objavljenem postopku [30].Svež dvanajstnik smo fiksirali s fiksativom za tkivne celice, vdelali v parafin, razrezali na 4 μm odseke, obarvali s H&E in analizirali pod svetlobnim mikroskopom.Reprezentativne patološke spremembe v sedmih odsekih tkiva sedmih neodvisnih miši je ocenil patolog, ki ni vedel za zdravljenje, in so bile zajete pri 200-kratni povečavi.Dolžino resic in globino kript smo izmerili po prej opisanih metodah.
Rezultati in vitro in in vivo so bili pridobljeni v treh izvodih.Grafi so bili ustvarjeni z uporabo GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ZDA).Razlike med dvema skupinama so bile analizirane s t-testom, medtem ko so bile razlike med skupinami ≥3 analizirane z enosmerno analizo variance (ANOVA) z uporabo programske opreme SPSS (različica 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ZDA).Podatki so bili analizirani glede homogenosti variance z uporabo Levenovega testa, ki mu je sledil Bonferronijev post hoc test (B).Pomembnost je izražena kot P<0,05, P<0,01 in P<0,001 (ni pomembno [ns]) (P>0,05).
Naša prejšnja analiza proteomike GEV v kjotski enciklopediji genov in genomov (KEGG) je pokazala, da so lahko številne tarče vključene v aktivacijo vnetnih signalnih poti [13].Izbrali smo dve obetajoči tarči, alfa-2 in alfa-7.3 giardine, pomnožimo te molekule in jih uporabimo za konstrukcijo evkariontskega ekspresijskega vektorja pcDNA3.1(+).Po sekvenciranju so bili rekombinantni ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 in alpha-7.3 giardine transfektirani v primarne mišje peritonealne makrofage in identificiran je bil podpisni protein kaspaze-1 p20 vnetja (fragment aktivirane kaspaze-1). kot pojasnjevanje ključnih molekul, ki lahko sprožijo vnetje.Rezultati so pokazali, da lahko alfa-2 in alfa-7.3 giardini inducirata ekspresijo p20 kaspaze-1, podobno kot GEV.Pri neobdelani negativni kontroli (samo PBS) in plazmidni kontroli pcDNA3.1(+) niso ugotovili nobenega učinka na aktivacijo kaspaze-1 (slika 1).
Merjenje aktivacije p20 kaspaze-1 s pcDNA3.1(+)-alfa-2 in alfa-7.3 giardini.Rekombinantne evkariontske ekspresijske plazmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 in alpha-7.3 giardine (nad vsako stezo) smo transfektirali v primarne mišje peritonealne makrofage in supernatante kulture pobrali 24 ur kasneje.Western blot je bil uporabljen za merjenje ravni ekspresije značilnega inflammasomskega proteina kaspaze-1 p20.Skupina za zdravljenje samo s PBS (proga C) in skupina za monoterapijo pcDNA3.1(+) (proga pcDNA3.1) sta bili uporabljeni kot negativna kontrola, skupina za zdravljenje z GEV pa je bila uporabljena kot pozitivna kontrola.Ekspresija rekombinantnega proteina je bila potrjena z detekcijo histidinske oznake v vsakem proteinu, pričakovani proteinski trakovi pa so bili alfa-2 giardin (38,2 kDa) in alfa-7,3 giardin (37,2 kDa).GEV, zunajcelični vezikli Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-lineariziran vektor, SUP, supernatant
Da bi ugotovili, ali alfa-2 giardin in alfa-7.3 giardin inducirata ekspresijo p20 kaspaze-1 in igrata vlogo pri aktiviranju vnetnega odziva NLRP3 gostitelja, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin in pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin je bil transfektiran v primarne mišje peritonealne makrofage z rekombinantno plazmidno DNA in določeni so bili nivoji izražanja, lokalizacije in oligomerizacije ključnih vnetnih proteinov NLRP3.V tem poskusu je bil GEV uporabljen kot pozitivna kontrolna skupina, skupina brez zdravljenja (samo PBS) ali skupina za zdravljenje s transfekcijo pcDNA3.1(+) pa je bila negativna skupina.Rezultati so pokazali, da je, tako kot v skupini GEV, rekombinantna plazmidna DNA giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 in giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 povzročila regulacijo NLRP3, pro-IL-1β in aktivacija prokapaze-1 in kaspaze-1 (slika 2a).Poleg tega sta obe giardini povzročili znatno izločanje IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (slika 2b).Večina proteinov ASC je bila monomernih v skupini brez zdravljenja ali v skupini, ki je bila zdravljena, transficiranih s plazmidom pcDNA3.1(+), v nasprotju s pcDNA3.1(+)-alfa-2 ali pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardine.Do oligomerizacije ASC je prišlo v rekombinantni plazmidni DNA skupine ali skupine pozitivne kontrole GEV, ki kaže oligomerno obliko (slika 2c).Ti predhodni podatki kažejo, da lahko alfa-2 giardin in alfa-7,3 giardin povzročita aktivacijo vnetja NLRP3.Poznejše imunofluorescenčne študije lokalizacije ASC in NLRP3 so pokazale, da je bil v negativni kontrolni skupini protein ASC razpršen po citoplazmi in se je pojavil kot pikčasti signal po stimulaciji pcDNA3.1(+)-alpha-2 z giardinom ali pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardine skupina ali GEV pozitivna kontrolna skupina (slika 2d).V negativni kontroli in skupinah pcDNA 3.1, obdelanih s plazmidom, proteinski signal NLRP3 ni bil zaznan, medtem ko je fluorescenčna signalna pika kot odziv na pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ali pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 je bil zaznan..giardine najdemo v citoplazmi ali ob stimulaciji HEV (slika 2e).Ti podatki nadalje dokazujejo, da G. duodenalis giardin alpha-2 in giardin alpha-7.3 aktivirata inflamasom NLRP3 v mišjih primarnih peritonealnih makrofagih.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin in pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin aktivirata inflammasom NLRP3 v mišjih peritonealnih makrofagih.Transfektirajte rekombinantna evkariontska ekspresijska plazmida pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin in pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin v primarne mišje peritonealne makrofage in celice ali poberite supernatant v 24 urah za analizo izražanja, oligomerizacijo , izločanje.in lokalizacija ključnih vnetnih proteinov.Skupina samo s PBS (C) in skupina z enim zdravljenjem s pcDNA3.1(+) sta bili uporabljeni kot negativna kontrola, skupina z GEV pa je bila uporabljena kot pozitivna skupina.a Ključni vnetni proteini NLRP3, vključno z NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspazo-1 in p20 kaspazo-1, so bili odkriti z Western blottingom.b Ravni izločanja IL-1β v supernatantih so bile določene z uporabo encimsko vezanega imunskega testa (ELISA).Razlike med kontrolno in eksperimentalno skupino smo analizirali z enosmerno analizo variance (ANOVA) z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0.Zvezdice označujejo pomembne razlike med skupinama **P<0,01 in ***P<0,001.c Ravni oligomerizacije ASC v peletih so bile določene z analizo navzkrižnega povezovanja DSS, medtem ko so bile ravni ASC v celičnih lizatih uporabljene kot kontrola obremenitve.d Vizualizacija lokalizacije ISC z uporabo imunofluorescence.e Imunofluorescenca je bila uporabljena za vizualizacijo lokalizacije NLRP3.ASC, apoptotični pegasti protein;IL, interlevkin;NLRP3, oligomerizaciji podoben receptor 3, ki veže nukleotide;ns, nepomembno (P > 0,05)
G. duodenalis in GEV, ki jih izloča, aktivirajo inflammasom NLRP3 in uravnavajo vnetne odzive gostitelja in vitro.Tako ostaja vloga inflammasoma NLRP3 pri patogenosti G. duodenalis nejasna.Da bi raziskali to težavo, smo zasnovali poskus med mišmi, okuženimi s cisto G. duodenalis, in mišmi, okuženimi s cisto G. duodenalis + zdravljenje z zaviralcem MCC950, in primerjali ekspresijo vnetja NLRP3 pri okužbi s cisto G. duodenalis.Podrobna shema eksperimenta je prikazana na sliki 3a.Spremembe telesne teže miši v različnih zdravljenih skupinah smo spremljali 7 dni po okužbi s cistami, rezultati pa so prikazani na sliki 3b.V primerjavi s skupino, zdravljeno s čistim PBS, so rezultati pokazali, da (i) se je telesna teža miši, okuženih s cisto G. duodenalis, zmanjšala od 3. do 7. dne po okužbi;(ii) zdravljenje z zaviralcem MCC950 ni imelo pomembnega učinka na telesno težo miši..V primerjavi s skupino z eno okužbo se je BW skupine z okužbo dvanajstnika, zdravljene z MCC950, zmanjšala v različnih stopnjah (1. dan: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. dan: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; 3. dan: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; 4. dan: ANOVA, F (3, 24) = 1,683, P = 0,0052; 5. dan: ANOVA, F (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; 6. dan: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175; 7. dan: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Ti podatki kažejo, da inflammasom NLRP3 ščiti miši pred znatno izgubo teže v zgodnjih fazah (2-4 dni) okužbe dvanajstnika.Nato smo želeli odkriti trofozoite G. duodenalis v tekočini za izpiranje dvanajstnika in rezultati so prikazani na sliki 3c.V primerjavi s skupino okužbe s cisto G. duodenalis se je število trofozoitov v dvanajstniku znatno povečalo po blokiranju vnetja NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Tkiva dvanajstnika, obarvana s HE, so v primerjavi z negativno kontrolo, zdravljeno samo s PBS in MCC950, pokazala: (i) okužba s cisto G. duodenalis je povzročila poškodbo duodenalnih resic (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) in atrofija kript (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) dvanajstniku miši, okuženih s cistami G. duodenalis in zdravljenih z zaviralci MCC950.duodenalne resice so bile poškodovane in odmrle (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) z atrofijo in razvejanostjo kripte (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (slika 3d- f) .Ti rezultati kažejo, da ima vnetje NLRP3 vlogo pri zmanjševanju patogenosti G. duodenalis.
Vloga inflammasoma NLRP3 pri okužbi z Giardia duodenum.Miši so dali (iv) duodenokokne ciste in jih nato zdravili z MCC950 (ip) ali brez njega.Kot kontrole so bile uporabljene posamezne tretirane skupine s PBS ali MCC950.Eksperimentalna skupina in režim zdravljenja.b Telesno težo miši v vsaki od različnih zdravljenih skupin smo spremljali 7 dni.Razlika med skupino okužbe z G. duodenalis in skupino zdravljenja okužbe z G. duodenalis + MCC950 je bila analizirana s t-testom z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0.Zvezdice označujejo pomembne razlike pri *P<0,05, **P<0,01 ali ***P<0,001.c Parazitna obremenitev je bila določena s štetjem števila trofozoitov v izpiralni tekočini dvanajstnika.Razlika med skupino okužbe z G. duodenalis in skupino zdravljenja okužbe z G. duodenalis + MCC950 je bila analizirana s t-testom z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0.Zvezdice označujejo pomembne razlike pri *P <0,05.d Rezultati obarvanja s hematoksilinom in eozinom (H&E) histopatologije dvanajstnika.Rdeče puščice označujejo poškodbe resic, zelene puščice označujejo poškodbe kript.Merilna lestvica: 100 µm.e, f Statistična analiza višine duodenalnih resic in višine mišje kripte.Zvezdice označujejo pomembne razlike pri *P<0,05 in **P<0,01.Rezultati so vzeti iz 7 neodvisnih bioloških poskusov.BW, telesna teža;ig, intragastrična dobavna pot;ip, intraperitonealna porodna pot;ns, nepomembno (P > 0,05);PBS, fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom;WT, divji tip
Izločanje IL-1β je znak aktivacije vnetja.Da bi ugotovili, ali G. duodenalis alpha-2 giardine in alpha-7.3 giardine aktivirata gostiteljski inflamasom NLRP3 in vivo, smo uporabili nezdravljene WT miši (navidezna skupina) in miši, blokirane z vnetjem NLRP3 (zdravstvena skupina, inhibirana z MCC950).Podrobna shema poskusa je prikazana na sliki 4a.Eksperimentalne skupine so sestavljale miši, zdravljene s PBS, zdravljenje ciste G. duodenalis z gavažo, intramuskularno injekcijo pcDNA3.1 in intramuskularno injekcijo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina ali pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina.7. dan po intramuskularnem dajanju rekombinantnega plazmida smo zbrali serum in določili nivo IL-1β v vsaki skupini.Kot je prikazano na sliki 4b, v skupini MOCK: (i) v primerjavi s skupino PBS zdravljenje s pcDNA3.1 ni pomembno vplivalo na izločanje IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), vendar Izločanje IL-β je bilo znatno povišano v skupini ciste G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine in pcDNA3.1- Intramuskularna injekcija alfa-7,3 giardina je znatno povečala serumske ravni IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine povzroča visoke ravni izločanja IL -1β v skupini za intramuskularno injiciranje pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .V primerjavi z vsako skupino v zdravljeni skupini MCC950 in skupini MOCK: (i) ravni izločanja IL-1β v kontrolni skupini PBS in kontrolni skupini pcDNA3.1 so se do določene mere zmanjšale po blokiranju zaviralca MCC950, vendar razlika ni bila signifikantno (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) po blokiranju MCC950., je bilo izločanje IL-1β znatno zmanjšano v skupini, okuženi s cisto G. duodenalis, skupini z giardinom pcDNA3.1-alfa-2 in skupini z giardinom pcDNA3.1-alfa-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, P = 0,0164).Ti rezultati kažejo, da alfa-2 giardin in alfa-7.3 giardin posredujeta pri aktivaciji inflamasoma NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardini aktivirajo gostiteljski inflamasom NLRP3 in vivo.Miši so bile imunizirane (IM) z rekombinantnim evkariontskim ekspresijskim plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ali pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine in nato zdravljene z MCC950 (ip; skupina MCC950) ali ne (navidezna skupina) ).Skupina za zdravljenje s plazmidom PBS ali pcDNA3.1(+) je bila uporabljena kot negativna kontrola, skupina za zdravljenje ciste G. duodenalis je bila uporabljena kot pozitivna kontrola.Eksperimentalna skupina in režim zdravljenja.b Serumske ravni IL-1β pri miših so bile izmerjene 7. dan s testom ELISA.Razlike med skupinami v skupini MOCK so bile analizirane z uporabo enosmerne ANOVA, razlike med skupinama MOCK in skupino MCC950 pa so bile analizirane s t-testom programske opreme SPSS različice 22.0.Zvezdice označujejo pomembne razlike med zdravljenimi skupinami v skupini MOCK, *P<0,05 in ***P<0,001;znaki za dolar ($) kažejo pomembne razlike med vsako skupino v skupini MOCK in skupini MCC950 pri P<0,05.Rezultati sedmih neodvisnih bioloških poskusov.i, intramuskularna injekcija, ns, nepomembno (P > 0,05)
Da bi raziskali učinek alfa-2 in alfa-7.3 giardina posredovane aktivacije inflamasoma gostitelja NLRP3 na infektivnost G. duodenalis, smo uporabili WT C57BL/6 miši in injicirali alfa-2 giardin in alfa-7.3 giardin.plazmid smo injicirali intramuskularno, po 3 dneh skozi želodčno cevko ciste G. duodenalis, nakar smo miši opazovali 7 dni.Podrobna shema poskusa je prikazana na sliki 5a.Vsak dan smo merili telesno težo vsake miši, 7. dan po dajanju skozi želodčno sondo odvzeli vzorce svežega duodenalnega tkiva, izmerili število trofozoitov in opazovali histopatološke spremembe.Kot je prikazano na sliki 5b, se je s povečevanjem časa hranjenja BW miši v vsaki skupini postopoma povečevala.MT miši se je začel zmanjševati 3. dan po intragastričnem dajanju cist G. duodenalis, nato pa se je postopoma povečeval.Aktivacija inflammasoma NLRP3, inducirana z intramuskularno injekcijo alfa-2 giardina in alfa7.3 giardina, je bistveno zmanjšala izgubo teže pri miših (1. dan: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 1. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 2. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; 2. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; 3. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; 4. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, 5. dan: pcDNA3.1-alfa - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5. dan: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6. dan: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. dan: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazitsko obremenitev smo ocenili v dvanajstniku (slika 5c).V primerjavi z netretirano pozitivno kontrolo in skupino, ki ji je bil vbrizgan prazen vektor pcDNA3.1, je bilo število trofozoitov G. duodenalis znatno zmanjšano v skupinah, ki sta ji vbrizgali α-2 giardin in α-7,3 giardin (pcDNA3.1-alfa -2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Poleg tega je bil giardine alfa-7.3 bolj zaščiten pri miših kot giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Rezultati barvanja s HE so prikazani na sl.5d–f.Miši, ki so jim injicirali alfa-2 giardine in alfa-7,3 giardine, so imele manj lezij duodenalnega tkiva, ki so se kazale s poškodbo resic, v primerjavi z mišmi, ki so jim injicirali G. duodenalis, in mišmi, ki so jim injicirali G. duodenalis v kombinaciji s praznim vektorjem pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 ali P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 ali P = 0,0055) in zmanjšana atrofija kript (giardina pcDNA3.1-alpha-2: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 ali P = 0,0158; giardina pcDNA3.1-alfa-7.3: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ali P = 0,0191).Ti rezultati kažejo, da alfa-2 giardin in alfa-7,3 giardin zmanjšata infektivnost G. duodenalis z aktiviranjem inflamasoma NLRP3 in vivo.
Vloga pcDNA3.1(+)-giardinov pri okužbi z G. duodenalis.Miši smo imunizirali (IM) z rekombinantnimi evkariontskimi ekspresijskimi plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ali pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine in nato izzvali s cistami G. duodenalis (ig).Skupina PBS in skupina za zdravljenje pcDNA3.1(+) + duodenalne ciste sta bili uporabljeni kot negativni kontrolni skupini, skupina za zdravljenje duodenalne ciste pa je bila uporabljena kot pozitivna kontrolna skupina.Eksperimentalna skupina in režim zdravljenja.b MT miši v vsaki od različnih zdravljenih skupin smo spremljali 7 dni po izzivu.Zvezdice označujejo pomembne razlike med skupinama v skupini G. duodenalis in skupini pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 in ***P <0,001;znak za dolar ($) označuje pomembno razliko med vsako skupino G. duodenalis in skupino pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 in $$$P<0,001.c Parazitna obremenitev je bila določena s štetjem števila trofozoitov v 1 ml duodenalne lavaže iz dvanajstnika (dolžine 3 cm) in izražena kot število parazitov na cm dvanajstnika.Razlike med skupino okužbe z G. duodenalis, skupino pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine in skupino pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine so bile analizirane z enosmerno ANOVA z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0.Zvezdice označujejo pomembne razlike pri **P<0,01 in ***P<0,001.d Histopatološke spremembe na dvanajstniku.Rdeče puščice označujejo poškodbe resic, zelene puščice označujejo poškodbe kript.Merilna lestvica: 100 µm.e, f Statistična analiza višine mišjega dvanajstnika (e) in višine kripte (f).Razlike med skupinami na sliki 1d so bile analizirane z enosmerno ANOVA z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0.Zvezdice označujejo pomembne razlike pri *P<0,05 in **P<0,01.Rezultati sedmih neodvisnih bioloških poskusov.ns, nepomembno (P > 0,05)
Giardia duodenum je dobro znan črevesni parazit pri ljudeh in drugih sesalcih, ki povzroča giardiozo.Leta 2004 je bila vključena v pobudo SZO za zapostavljene bolezni zaradi visoke razširjenosti v zadnjih 6 letih, zlasti v skupnostih z nizkim socialno-ekonomskim statusom [32].Prirojeni imunski sistem igra ključno vlogo pri imunskem odzivu na okužbo z G. duodenalis.Poročali so, da mišji makrofagi zajamejo in ubijejo G. duodenalis s sproščanjem zunajceličnih pasti [33].Naše prejšnje študije so pokazale, da G. duodenalis, neinvazivni zunajcelični parazit, aktivira vnetne signalne poti p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 in NLRP3 v mišjih makrofagih za uravnavanje vnetnih odzivov gostitelja, sproščeni GEV pa lahko izboljša ta proces.13], 24].Vendar pa je treba natančne PAMP-je, vključene v vnetje, ki ga regulira NLRP3 inflammasom pri GEV, in vlogo vnetja NLRP3 pri giardiazi še pojasniti.Da bi osvetlili ti dve vprašanji, smo izvedli to študijo.
Inflammasom NLRP3 se nahaja v citoplazmi imunskih celic in ga lahko aktivirajo različni delci, kot so kristali sečne kisline, toksini, bakterije, virusi in paraziti.V bakterijskih študijah so bili toksini opredeljeni kot ključni PAMP, ki aktivirajo vnetne senzorje, kar povzroči vnetje in celično smrt [34].Nekateri strukturno raznoliki toksini, kot so hemolizin iz Staphylococcus aureus [35] in Escherichia coli [36], hemolizin BL (HBL) iz enterotoksina (NHE) [37], povzročijo aktivacijo vnetja NLRP3.Virusne študije so pokazale, da so virulenčne beljakovine, kot sta beljakovina ovojnice (E) SARS-COV-2 [38] in beljakovina NS5 virusa Zika [39], pomembni PAMP, ki jih prepozna receptor NLRP3.V študijah parazitov so poročali, da so številni paraziti povezani z aktivacijo inflamasoma gostitelja, kot so Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] in Leishmania [42].Proteini z gostimi zrnci GRA35, GRA42 in GRA43, povezani z virulentnostjo Toxoplasma gondii, so potrebni za indukcijo piroptoze v makrofagih podgane Lewis [43].Poleg tega so se nekatere študije Leishmanije osredotočile na posamezne molekule, vključene v inflamasom NLRP3, kot je lipofosfoglikan membrane parazita [44] ali cinkova metaloproteaza [45].Izmed aneksinu podobnih genov alfa-giardin se je izkazalo, da je alfa-1 giardin potencialni kandidat za cepivo, ki zagotavlja zaščito proti G. duodenalis v mišjem modelu [18].V naši študiji smo izbrali faktorje virulence G. duodenalis alfa-2 in alfa-7,3 giardine, ki so edinstveni za giardijo, a o njih relativno manj poročajo.Ta dva ciljna gena sta bila klonirana v vektor evkariontskega ekspresijskega sistema pcDNA3.1(+) za analizo aktivacije vnetja.
V našem mišjem modelu odcepljeni fragmenti kaspaze služijo kot markerji vnetne aktivacije.Po stimulaciji NLRP3 sodeluje z ASC, rekrutira prokapaze in ustvarja aktivne kaspaze, ki cepijo pro-IL-1β in pro-IL-18 v zrel IL-1β oziroma IL-18 -18.Vnetne kaspaze (kaspaze-1, -4, -5 in -11) so ohranjena družina cisteinskih proteaz, ki so ključne za prirojeno obrambo in sodelujejo pri vnetju in programirani celični smrti [46].Kaspazo-1 aktivirajo kanonični inflamasomi [47], medtem ko se kaspaze-4, -5 in -11 cepijo med tvorbo atipičnih inflamasomov [48].V tej študiji smo kot model uporabili mišje peritonealne makrofage in raziskali kaspazo-1, razcepljeno s p20 kaspazo-1, kot marker aktivacije vnetja NLRP3 gostitelja v študijah okužbe z G. duodenalis.Rezultati so pokazali, da so številni alfa-giardini odgovorni za tipično aktivacijo vnetja, kar je skladno z odkritjem ključnih virulentnih molekul, ki so vključene v bakterije in viruse.Vendar je naša študija le predhodni pregled in obstajajo tudi druge molekule, ki lahko aktivirajo neklasične inflamasome, saj je naša prejšnja študija odkrila tako klasične kot neklasične inflamasome pri okužbi z G. duodenalis [13].Za nadaljnjo ugotovitev, ali je ustvarjena p20 kaspaza-1 povezana z vnetjem NLRP3, smo transfektirali alfa-2 in alfa-7,3 giardine v peritonealne makrofage miši, da bi določili ključne ravni molekulske beljakovine in ravni oligomerizacije ASC, kar je potrdilo, da oba α-giardina aktivirata vnetni NLRP3.Naši rezultati se nekoliko razlikujejo od rezultatov Manko-Prykhoda et al., ki so poročali, da lahko stimulacija celic Caco-2 samo s sevi G. muris ali E. coli EPEC poveča intenzivnost fluorescence NLRP3, ASC in kaspaze-1, čeprav ne bistveno, medtem ko je kostimulacija G. muris in E. coli povečala ravni treh proteinov [49].To neskladje je lahko posledica razlik v izbiri vrst Giardia, celičnih linij in primarnih celic.Izvedli smo tudi in vivo teste z uporabo MCC950 pri 5-tedenskih samicah miši WT C57BL/6, ki so bolj dovzetne za G. duodenalis.MCC950 je močan in selektiven zaviralec NLRP3 z majhno molekulo, ki blokira kanonično in nekanonično aktivacijo NLRP3 pri nanomolarnih koncentracijah.MCC950 zavira aktivacijo NLRP3, vendar ne vpliva na aktivacijo vnetnih poti AIM2, NLRC4 in NLRP1 ali signalnih poti TLR [27].MCC950 blokira aktivacijo NLRP3, vendar ne zavira iniciacije NLRP3, iztoka K+, dotoka Ca2+ ali interakcije med NLRP3 in ASC;namesto tega zavira aktivacijo inflamasoma NLRP3 z blokiranjem oligomerizacije ASC [27].Zato smo uporabili MCC950 v študiji in vivo, da bi določili vlogo inflamasoma NLRP3 po injiciranju giardina.Aktivirana kaspaza-1 p10 cepi vnetna citokina pro-IL-1β in pro-IL-18 v zrela IL-1β in IL-18 [50].V tej študiji so bile serumske ravni IL-1β pri miših, zdravljenih z giardinom, z ali brez MCC950 uporabljene kot indikator, ali je bil aktiviran inflammasom NLRP3.Kot je bilo pričakovano, je zdravljenje z MCC950 znatno zmanjšalo serumske ravni IL-1β.Ti podatki jasno kažejo, da lahko G. duodenalis giardin alfa-2 in giardin alfa-7.3 aktivirata mišji inflamasom NLRP3.
Pomembni podatki, zbrani v zadnjem desetletju, so pokazali, da je IL-17A glavni regulator imunosti proti G. muris, inducira signalizacijo IL-17RA, proizvaja protimikrobne peptide in uravnava aktivacijo komplementa [51].Vendar se okužba z Giardio pogosteje pojavlja pri mladih odraslih in poročali so, da okužba z Giardio pri mladih miših ne aktivira odziva IL-17A, da bi imel zaščitni učinek [52], kar je raziskovalce spodbudilo k iskanju drugih imunomodulatornih Giardia.Mehanizmi okužbe s helminti.Avtorji nedavne študije so poročali, da lahko G. muris aktivira inflammasom NLRP3 z E. coli EPEC, kar spodbuja proizvodnjo protimikrobnih peptidov in zmanjša njegovo sposobnost pritrditve ter število trofozoitov v črevesnem traktu, s čimer se zmanjša resnost debelega črevesa. bolezni, ki jih povzročajo bacili [49].Inflamasom NLRP3 je vpleten v razvoj različnih bolezni.Študije so pokazale, da Pseudomonas aeruginosa sproži avtofagijo v makrofagih, da bi se izognili celični smrti, in ta proces je odvisen od aktivacije inflamasoma NLRP3 [53].Za N. caninum aktivacija inflamasoma NLRP3, posredovana z reaktivnimi kisikovimi vrstami, omejuje njegovo replikacijo v gostitelju, zaradi česar je potencialna terapevtska tarča [9].Ugotovljeno je bilo, da Paracoccidioides brasiliensis inducira aktivacijo vnetja NLRP3 v dendritičnih celicah, pridobljenih iz mišjega kostnega mozga, kar povzroči sproščanje vnetnega citokina IL-1β, ki ima ključno vlogo pri obrambi gostitelja [10].Več vrst Leishmania, vključno z L. amazonensis, L. major, L. braziliensis in L. infantum chagasi, aktivira NLRP3 in ASC-odvisno kaspazo-1 v makrofagih, pa tudi okužbo z Leishmanio.Replikacija parazitov je povečana pri miših s pomanjkanjem gena NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni idr.Poročali so, da okužba z leishmanijo inducira aktivacijo inflamasoma NLRP3 v makrofagih, kar omejuje replikacijo znotrajceličnega parazita.Tako lahko Leishmania zavre aktivacijo NLRP3 kot strategijo izogibanja.V študijah in vivo je inflammasom NLRP3 prispeval k izločanju Leishmanije, vendar ni vplival na tkiva [54].Nasprotno pa je v študijah helminthiasis aktivacija inflammasoma NLRP3 zavrla gostiteljevo zaščitno imunost proti gastrointestinalnim helminthiasis [12].Shigella je ena glavnih bakterij, ki povzročajo drisko po vsem svetu.Te bakterije lahko inducirajo produkcijo IL-1β z izlivom K+, ki ga posreduje receptor P2X7, reaktivnimi kisikovimi vrstami, lizosomskim zakisavanjem in poškodbo mitohondrijev.Inflamasom NLRP3 negativno uravnava fagocitozo in baktericidno aktivnost makrofagov proti šigeli [55].Študije plazmodija so pokazale, da miši s pomanjkanjem AIM2, NLRP3 ali kaspaze-1, okužene s plazmodijem, proizvajajo visoke ravni interferona tipa 1 in so bolj odporne na okužbo s plazmodijem [56].Vendar pa vloga alfa-2 giardina in alfa-7.3 giardina pri induciranju patogene aktivacije vnetja NLRP3 pri miših ni jasna.
V tej študiji je inhibicija inflamasoma NLRP3 z MCC950 zmanjšala BW in povečala število trofozoitov v črevesni izpiralni tekočini pri miših, kar je povzročilo resnejše patološke spremembe v tkivu dvanajstnika.Alpha-2 giardine in alpha-7.3 giardine aktivirata inflammasom NLRP3 gostiteljske miši, povečata telesno težo miši, zmanjšata število trofozoitov v črevesni izpiralni tekočini in ublažita patološke duodenalne lezije.Ti rezultati kažejo, da lahko G. duodenalis aktivira inflammasom gostitelja NLRP3 preko alfa-2 giardina in alfa-7,3 giardina, kar zmanjša patogenost G. duodenalis pri miših.
Skupaj naši rezultati kažejo, da alfa-2 in alfa-7.3 giardini inducirata aktivacijo gostiteljskega inflamasoma NLRP3 in zmanjšata infektivnost G. duodenalis pri miših.Zato so te molekule obetavne tarče za preprečevanje giardiaze.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: pregled.Nedavno je bilo razkrito, da je Pat Inflamm alergičen na zdravila.2019; 13: 134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: pregled farmakoterapije.Strokovno mnenje farmacevta.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, odpornost na zdravila in odkrivanje novih tarč.Okuži tarče drog Disord.2010; 10: 295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T itd. NLRP3 inflamasomske in vnetne bolezni.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Vloga inflammasoma pri črevesnem vnetju in raku.Gastroenterologija.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonična in atipična aktivacija inflamasoma NLRP3 na križišču imunske tolerance in vnetja črevesja.predimuno.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Aktivacija inflamasoma NLRP3, ki jo posreduje ROS, je vključena v odgovor na okužbo z N. caninum.Vektor parazitov.2020; 13: 449.